蝦類黑變機(jī)理

1、蝦類黑變機(jī)理,多酚氧化酶,一 、引言 1 多酚氧化酶的性質(zhì) 2 酶促褐變的生理作用 二、酚氧化酶的生物化學(xué)和分子生物學(xué)性質(zhì) 三、褐變控制 1 物理處理 2 抑制劑,食品的外觀，風(fēng)味，質(zhì)地和營養(yǎng)價值是消費(fèi)者選擇食品時的四個因素。重要的是顏色，也是消費(fèi)者評價食品質(zhì)量的首要因素之一。通過酶促反應(yīng)或非酶促反應(yīng)形成的顏色，影響著許多水果、蔬菜和海洋食品。尤其是甲殼類食品的最重要的顏色反應(yīng)之一酶促褐變反應(yīng)，是多酚氧化酶引起

2、的，這種酶曾經(jīng)被稱為酚氧化酶，酚酶，一元酚和二元酚氧化酶和酪氨酸酶。,1 問題1.1黑變病 酚氧化酶能導(dǎo)致甲殼類，如龍蝦和蟹變黑，被稱為黑變病。1.2多酚氧化酶的性質(zhì) 多酚氧化酶能催化兩種基本的反應(yīng)。用苯酚和氧氣作底物，該反應(yīng)能在與羥基相連的位置催化羥基化反應(yīng)。第二步反應(yīng)是二元酚被氧化為鄰位苯醌，苯醌常通過非酶反應(yīng)機(jī)理進(jìn)一步氧化成黑色素（褐色產(chǎn)物）。,,,,+1/2O2,,O2,+ 2H2O,一元

3、酚氧化酶 一元酚氧化酶催化一元酚羥基化成為二元酚。 種酶被稱為酪氨酸酶，因?yàn)長-酪氨酸是主要的一元酚底物。,二元酚氧化酶 第二步反應(yīng)即二元酚被氧化成醌，被稱為二元酚氧化酶活力或兒茶酚氧化酶活力。進(jìn)一步反應(yīng)是兒茶酚被氧化成為鄰位-苯醌。,蟲漆酶 蟲漆酶（對-二元酚氧化酶，E.C.1.10.3.2）（DPO）是另外一種類型的含銅的多元酚氧化酶。對于其酚底物具有明顯的非特異性。底物被蟲漆酶氧化是由于單一電子反應(yīng)生成自由基

4、。氧氣被還原成水的同時酚類底物也被氧化。,1.2 酶促褐變的生理作用,抗病能力被認(rèn)為是多酚氧化酶在動物體內(nèi)的功能之一，主要存在于昆蟲和甲殼類動物中。該酶在動物體內(nèi)常以酶原或多酚氧化酶前體形式存在。 它對甲殼類動物中的骨化過程起到重要的作用。黑色素和部分聚合酚醛塑料具有抗微生物的性質(zhì)。據(jù)說特殊的微生物能誘導(dǎo)產(chǎn)生能激活多酚氧化酶的蛋白酶。微生物次級代謝產(chǎn)物例如，葡聚糖，糖蛋白，脂多糖，海帶多糖和其它一些產(chǎn)物也能誘導(dǎo)產(chǎn)生能激活多酚氧化酶的

5、蛋白酶。,,,2．酚氧化酶的生物化學(xué)和分子生物學(xué)性質(zhì),PPOs是含銅的蛋白質(zhì)。在所有PPO順序中最顯著的特征是兩個銅結(jié)合位點(diǎn)，被稱為CuA和CuB。PPO的活性位點(diǎn)由兩個銅離子構(gòu)成，每個銅離子與三個保守的組氨酸殘基結(jié)合。這一對銅離子是PPO 與氧氣和酚類底物相互作用的位點(diǎn)。,在甲殼類中，PPO體系以無活性的酚氧化酶原（proPO）形式存在于血淋巴中，因此，PPO來源于血藍(lán)蛋白。血藍(lán)蛋白是在甲殼類血淋巴的血漿中發(fā)現(xiàn)的氧氣運(yùn)輸?shù)鞍?/p>

6、。血藍(lán)蛋白和PPOs存在由兩個銅離子直接與蛋白質(zhì)結(jié)合而形成的氧結(jié)合位點(diǎn)；但是，血藍(lán)蛋白不起催化作用。,純的proPO的分子量為76kDa。它是一種等電點(diǎn)在5.4左右的糖蛋白PPO活性的最適pH值在pH6.0和pH8.0之間。溫度對甲殼類PPO的穩(wěn)定性影響表明這些酶在20-50℃范圍內(nèi)具有相似的穩(wěn)定性。,PPOs的穩(wěn)定性是非常不同的，它依賴于許多因素，如溫度，pH，底物濃度，離子強(qiáng)度，緩沖體系等。,,,3．褐變控制,多酚氧化酶

7、（PPO）催化酚氧化生成鄰位-醌。鄰位-醌是活性很強(qiáng)的化合物。它們自發(fā)聚合形成高分子量化合物或黑色素，或與氨基酸和蛋白質(zhì)反應(yīng)而加深顏色。阻止酶促褐變可以通過多種途徑來實(shí)現(xiàn)。方法論上是除去一種或多種反應(yīng)必需的成分：氧氣、酶、銅或底物。,3.1 物理處理加熱冷藏冷凍干燥輻射高壓和超臨界CO2,,,,,,,,3.2 抑 制 劑,褐變抑制劑在食品加工中的應(yīng)用受毒性，對味道，風(fēng)味，質(zhì)地和價值的影響因素的制約，用于防止酶促褐變的

8、抑制劑有 5類：1）還原劑；2）螯合劑；3）酸化劑； 4）酶抑制劑；5）絡(luò)合劑；,,,3.2.1 還原劑/抗氧化劑,亞硫酸鹽試劑 硫酸鹽是PPO的一種競爭性抑制劑，能使PPO活性位點(diǎn)的巰基結(jié)合。 L-抗壞血酸 抗壞血酸抑制的機(jī)理基本上被歸結(jié)為還原-酶促形成鄰位-醌成原來的二元酚，從而阻止色素的形成。 異抗壞血酸 異抗壞血酸和它的鹽異抗壞血酸鈉都是很強(qiáng)的還原劑。它們是氧惰性劑，因此能抵抗還原分子中的氧 。酚

9、類抗氧化劑 抗氧化劑通過抑制生成自由基的氧化反應(yīng)過程，螯合金屬和惰性單線態(tài)氧來延緩酸敗或變色，從而保藏食品。 半胱氨酸 半胱氨酸能抑制黑變病被推測是形成了無色的硫醇-鄰位-醌，它甚至直接與PPO上的銅生成穩(wěn)定的復(fù)合物而抑制酶活。,,3.2.2 酸化劑,酸化劑的作用是將pH控制在PPO最佳催化活性所要求的pH之下。酸化劑如，檸檬酸，蘋果酸；磷酸能將pH降到3以下，在這個pH下PPO是無活性的。酸化劑經(jīng)常與其他抗褐變劑結(jié)合使用。檸檬

10、酸和抗壞血酸一種是食品工業(yè)中使用的最廣泛的酸之一。,3.2.3、螯合劑,在它們的活性位點(diǎn)有金屬離子，因此通過螯合劑除去它們的金屬離子將使酶失去活性。螯合劑通過它們能起到絡(luò)合或螯合的作用的分子結(jié)構(gòu)中的不共用電子對與強(qiáng)氧化劑如銅鐵離子絡(luò)合。由于PPO 是含銅的金屬蛋白像輔基一樣，它將被金屬螯合劑抑制。在食品中應(yīng)用的最好的GRAS螯合劑是檸檬酸和乙二胺環(huán)己酸（EDTA）。,EDTA EDTA與鐵、銅、鈣通過螯合反應(yīng)生成非常穩(wěn)定的絡(luò)合物。在羧

11、基完全解離的高pH下，EDTA的螯合效果最好。在阻止酶促褐變中，EDTA通常與其他化合試劑合用。,磷酸鹽 多磷酸鹽，焦磷酸鈉，金屬磷酸鹽都是螯合劑，由于它們在冷水中是微溶的，因而用在食品中作為抗褐變試劑時的濃度為0.5-2%。麥芽酚 麥芽酚（3-羥基-2-甲基-4氫-吡喃-4-one），一種γ吡喃酮的衍生物。麥芽酚不能直接抑制PPO，但它能通過與鄰位-醌的結(jié)合使其重新生成鄰位-二羥基醌或使PPO不可逆滅活來抑制褐變。曲酸

12、曲酸（5-羥基-2-羥甲基-4H-吡喃-4-one）是一種γ吡喃酮衍生物，是許多曲霉菌和青霉菌的代謝產(chǎn)物。酪氨酸酶被曲酸的抑制可能是由于它能和酶活性位點(diǎn)的銅結(jié)合，因?yàn)榍崾欠浅：玫倪^渡金屬如鐵（Ⅲ）和銅（Ⅱ）的螯合劑。,3.2.4、 絡(luò)合劑,甲殼胺 甲殼胺來源于有殼的水生動物，甲殼質(zhì)為β（1，4）-D-胺基葡萄糖的多聚體。甲殼胺無毒，生物可降解，有抗微生物作用。作用機(jī)理還不清楚，可能是帶正電荷的多聚體能吸收懸浮的PPO的底物或產(chǎn)物的原

13、故。 環(huán)狀糊精 環(huán)狀糊精是一類由液化淀粉在葡聚糖轉(zhuǎn)移酶作用下經(jīng)環(huán)狀麥芽糊精而生成的環(huán)狀寡糖。CD抑制褐變的機(jī)理主要是它們能與PPO的底物結(jié)合。β-CD的中央空穴有較弱的非極性與PPOs酚類形成包含絡(luò)合物，因而能阻止醌的氧化和隨后的聚合，從而阻止黑色素的生成,,3.2.5、 酶抑制劑,4-已基間苯二酚 被取代的間苯二酚，它們的結(jié)構(gòu)與酚類底物相關(guān)，被認(rèn)為是PPO的抑制劑。間苯二酚衍生物與酚類底物的結(jié)構(gòu)相類似，通過對PPO的競爭性抑制

14、來阻止褐變反應(yīng)。4-已基間苯二酚（4-HR）能抑制酪氨酸的一元酚氧化酶和二元酚氧化酶活性。鹵化鹽 無機(jī)鹵化鹽是很有名的PPO抑制劑。NaF是最強(qiáng)的PPO抑制劑，其他依次是NaCl，NaBr，和NaI。 蜂蜜 蜂蜜可以抑制酶促褐變。蜂蜜對PPO起抑制作用的化合物是分子量為600的小肽。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)、肽和氨基酸通過螯合PPO活性中心的Cu2+形成穩(wěn)定絡(luò)合物來抑制PPO的活性，這可能就是蜂蜜肽的抑制機(jī)理。,,,氨基酸，肽

15、和蛋白質(zhì) 氨基酸，肽和蛋白質(zhì)通過直接抑制酶或通過與PPO催化產(chǎn)物醌反應(yīng)來抑制PPO催化的褐變。它們也能通過與催化各酚底物螯合PPO的活性位點(diǎn)的銅來抑制PPO活性。蛋白質(zhì)，肽和α-氨基酸能和銅離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。組氨酸和半胱氨酸對銅離子有特別高的親和力，因?yàn)榻M氨酸有咪唑環(huán)，半胱氨酸有巰基，二者都能連接金屬離子。,芳香族羧酸 苯甲酸和肉桂系列的芳香族羧酸是PPO的抑制劑，同時它們的結(jié)構(gòu)與底物的結(jié)構(gòu)相類似。肉桂酸和它的類似物，對位-

16、對羥基桂皮酸，阿魏酸和芥子酸被發(fā)現(xiàn)是植物PPO的強(qiáng)烈抑制劑。,對蝦黑變的新機(jī)理,,我國海捕蝦產(chǎn)量,海水養(yǎng)殖蝦產(chǎn)量,南美白對蝦（P.vannamei）,南美白對蝦原分布在中、南美洲太平洋沿岸水域，外形似中國對蝦，正常體色為淺灰色，殼薄體肥，肉質(zhì)鮮嫩，出肉率高達(dá)65%以上，營養(yǎng)豐富，深受國內(nèi)外市場歡迎；生長速度快，養(yǎng)殖60天即可上市；,為當(dāng)前世界上養(yǎng)殖最普遍的品種。我國南方沿?？梢责B(yǎng)兩茬。該蝦生長快，適應(yīng)性強(qiáng)，食性雜，巳可耐受較長時間的干露

17、，故易干活運(yùn)銷。該蝦是對蝦中個體最大的一種，發(fā)現(xiàn)的最大個體長達(dá)33厘米，體重500～600克。,斑節(jié)對蝦P. monodon,日本對蝦Penaeus japonicus,日本對蝦是日本最重要的對蝦養(yǎng)殖品種，在日本養(yǎng)到25克左右出售價格最高，,鷹爪蝦（對蝦科）Trachypenaeus curvirostris,中國水產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易情況,中國2002年出口量排列前五位的依次是凍魚及魚片（占46.1%），頭足類（占18.1%），各種加工魚

18、類及罐頭（5.8%），養(yǎng)殖蝦（5.2%）和烤鰻（3.2%）出口額排在前五位的是凍魚及魚片（30.0%），頭足類（16.4%），烤鰻（12.6%），養(yǎng)殖蝦（12.2%），加工魚類及罐頭（6.0%）,1、引起蝦類黑變真正原因是什么？2、血藍(lán)蛋白是怎樣被激活的？3、血藍(lán)蛋白在對蝦中的存在位置？4、血藍(lán)蛋白僅僅氧化酪氨酸嗎？5、是否還有其它因素能引起蝦類的黑變？,1、引起蝦類黑變真正原因是什么？,DOPA,,,,,Melanin,,

19、,DOPA quinone,,5, 6-dihydroxyindole (DHI),DOPA chrome,,Phenoloxidase (PO),,,,Tyrosine,蝦類黑色素的形成 -目前普遍被接受的形成機(jī)理,,,多酚氧化酶酶原的激活機(jī)理,Prophenoloxidase(ProPO),,Phenoloxidase(PO),,,ProPO System,Beta-1,3 glu

20、can, LPS, Peptidoglycan,,,,prophenoloxidase activating factor,p-APMSF,,,?－1,3葡聚糖， 脂多糖，肽聚糖,,,,,,,,,,,,,,,,,0,20,40,60,80,100,120,1,2,3,4,0,Storage time (week),,,,,,,,,,,,PO activity during storage at –20℃,Residual a

21、ctivity (%),多酚氧化酶原的cDNA序列及由cDNA序列推導(dǎo)出的氨基酸序列,Pacifastacus leniusculus prophenoloxidase,Bombyx mori prophenoloxidase,Drosophila melanogaster prophenoloxidase,Homo sapiens tyrosinase,Oryzias latipes tyrosinase,Neurospora cra

22、ssa tyrosinase,Sinorhizobium meliloti tyrosinase,,Proteins,identity (%),57,35,38,15,13,11,14,,Panulirus interruptus hemocyanin subunit A,Penaeus vannamei hemocyanin,Eurypelma californicum hemocyanin subunit a,29,30,38,不同

23、來源的多酚氧化酶原氨基酸序列的同源性比較,pjppo,,0.1,,lycopoA,,sopo,,mdpo,,papo,,,1000,,,889,,,,1000,,olty,,rnty,,ggty,,hsty,,mmty,,,1000,,,999,,,994,,,1000,,,,bdhex,,mdhex,,aghex,,amhex,,,,1000,,,886,,,,1000,,pihca,,pihcb,,,1000,,pihcc,,pvh

24、c1,,pvhc2,,,1000,,,998,,,,1000,,agppo1,,bmppo1,,,1000,,bmppo2,,msppo,,,1000,,,723,,dmppo,,gam2,,agppo3,,agppo6,,,1000,,,987,,agppo4,,agppo5,,,1000,,,962,,,1000,,,1000,,plppo,,,,1000,,,825,,echcb,,echcc,,,1000,,echca,,ech

25、cf,,echce,,echcg,,,441,,,,520,,echcd,,,,,977,,,504,,,,1000,,,,1000,,,853,,,,1000,,,417,,,973,,,,973,Plant phenoloxidase,Vertebrate tyrosinase,Crustacean hemocyanin,Insect phenoloxidase,Chelicerate hemocyanin,Crustacean p

26、rophenoloxidase,nsty,smty,Microbial tyrosinase,Insect hexamerin,Dendrogram of POs,2、血藍(lán)蛋白是怎樣被激活的？,血藍(lán)蛋白 (Hc):,由肝胰腺分泌在血清中作為氧的運(yùn)輸載體可作為滲透壓調(diào)節(jié)劑、蛻皮激素載體、抗菌肽前體從基因序列看，與多酚氧化酶有較大的同源性被激活后，具有多酚氧化酶活性,血細(xì)胞組分在激活血藍(lán)蛋白的過程中起重要作用,血藍(lán)蛋白的激

27、活,Hc: Hemocyanin HLS: Hemocyte Lysate Supernatant,A and C: Activated HemocyaninB and D: Native Hemocyanin,,,Native Hc,Activated Hc,,血藍(lán)蛋白的激活機(jī)理,,S-S bond,3、血藍(lán)蛋白在對蝦中的存在部位？,血藍(lán)蛋白存在于蝦類的表皮?,在蝦的表皮會發(fā)生明顯的黑變,,表皮中的血藍(lán)蛋白,100 mm,Stai

28、ned with (A)Antibody, (B) Toluidine blue, (C) Negative Control, (D) Secondary antibody,Dorsal,Ventral,,,,,Epicuticle,Endocuticle,Exocuticle,A,B,C,D,,4、血藍(lán)蛋白僅僅氧化酪氨酸嗎？,DOPA,,,,,Melanin,,,DOPA quinone,,5,

29、 6-dihydroxyindole (DHI),DOPA chrome,,Hemocyanin,,,,Tyrosine,血藍(lán)蛋白引起的蝦類黑色素的形成過程,,,?,?,DHI and DHICA,5,6--Dihydroxyindole-2-carboxylic acid(DHICA),5,6-Dihydroxyindole(DHI),DHI的吸收光譜,,DOPA,,,,,Melanin,,,DOPA quinone,,5, 6-

30、dihydroxyindole (DHI),DOPA chrome,,Hemocyanin,,,,Tyrosine,血藍(lán)蛋白引起的蝦類黑色素的形成過程,,,?,,5、是否還有其它因素能引起蝦類的黑變？,DOPA,,,,,Melanin,,,DOPA quinone,,5, 6-dihydroxyindole (DHI),DOPA chrome,,Hemocyanin,,,,Tyrosine,其它因子在蝦類黑變過程中的協(xié)同作用？,,,?,

31、黑變協(xié)同因子（MCF）在蝦類黑變過程中是必需的,｛,｛,A,B,C,5,10,25,15,30,20,50,35,60,45,40,55,Reaction time,｛,A：Hemocyanin＋MCF＋ＤＯＰＡ,B：Hemocyanin＋ＤＯＰＡ,C：MCF ＋ＤＯＰＡ,Min.,MCF活性在對蝦凍結(jié)貯藏過程中的變化,Activity staining MCF,,160kDa,１,２,３,０,DOPA,,,,,Melanin,,,DO

32、PA quinone,,5, 6-dihydroxyindole (DHI),DOPA chrome,,Hemocyanin,,,,Tyrosine,MCF與血藍(lán)蛋白的協(xié)同作用,,,MCF,結(jié) 論,血藍(lán)蛋白能引起蝦類的黑變 ；血細(xì)胞組分能打斷血藍(lán)蛋白中的二硫鍵，從而活化血藍(lán)蛋白；血藍(lán)蛋白存在于蝦類外表皮和內(nèi)表皮；在血藍(lán)蛋白的作用下，5,6-二羥基吲哚（DHI)轉(zhuǎn)變成黑色素類物質(zhì)；在黑變協(xié)同因子（MCF）的作用下，多吧色素（D