編制說明-糧油檢驗 谷物中黃曲霉毒素b1的測定 時間分辨熒光免疫層析定量法-征求意見稿

1、1《糧油檢驗《糧油檢驗谷物中黃曲霉毒素谷物中黃曲霉毒素B1B1的測定的測定時間分辨熒光免疫層析定量法》標(biāo)準(zhǔn)編制說明間分辨熒光免疫層析定量法》標(biāo)準(zhǔn)編制說明黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是一類由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，是最為常見的真菌毒素之一[13]，已知的黃曲霉毒素約20多種，其中黃曲霉毒素B1（AFB1）最為常見且毒性最強(qiáng)，具有強(qiáng)致癌和致突變性，毒性是砒霜的38倍，是迄今為止已知毒性最強(qiáng)的物質(zhì)之一，被國際癌癥研究

2、機(jī)構(gòu)列為Ｉ類致癌物。農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素污染范圍廣、環(huán)節(jié)多、管控難，隨著氣候變暖和農(nóng)業(yè)耕作方式的變化，中國農(nóng)產(chǎn)品受黃曲霉毒素污染呈加重趨勢，成為威脅農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)、消費者安全與國際貿(mào)易的重要風(fēng)險隱患。國內(nèi)外非常重視黃曲霉毒素的防控，為控制黃曲霉毒素的污染，我國在2005年頒布了糧食和食品中黃曲霉毒素B1（AFB1）的限量標(biāo)準(zhǔn)，2017年最新頒布的國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)《食品中真菌毒素限量》規(guī)定了玉米、玉米面（渣、片）及玉米制品中AFB1的最高限量為

3、20μgkg，稻谷、糙米、大米中AFB1的最高限量為10gkg，小麥、大麥、麥片、小麥粉、其它谷物及去殼谷物AFB1的最高限量為5μgkg[4]。目前，國標(biāo)（GB）規(guī)定的谷物中黃曲霉毒素B1的檢測方法有同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜柱前衍生法、高效液相色譜柱后衍生法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法和薄層色譜法。糧食行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（LST）規(guī)定的黃曲霉毒素B1的檢測方法有膠體金快速定量法。液相法或質(zhì)譜法處理過程復(fù)雜，需要大型精密儀器和專業(yè)人員操

4、作，費時、費力、費錢；薄層色譜法前處理過程復(fù)雜，費時費力；ELISA法和膠體金免疫層析法穩(wěn)定性相對較差，批間差大，均不能很好滿足快速檢測的要求?；鶎訖z測單位迫切需要方便、準(zhǔn)確、快速和低成本，可實現(xiàn)大量樣本快速篩查的黃曲霉毒素B1檢測方法，以滿足農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)過程監(jiān)控、現(xiàn)場監(jiān)督、檢查的工作需要。時間分辨熒光免疫層析定量法能很好地滿足上述要求。時間分辨熒光免疫分析技術(shù)（timeresolvedfluoimmunoassay，TRFIA）是20世

5、紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的一種新型非放射性免疫標(biāo)記技術(shù)，利用免疫反應(yīng)的高度特異性和標(biāo)記示蹤物的高度靈敏性相結(jié)合而建立的一類微量物質(zhì)檢測技術(shù)，其靈敏度、可測范圍和穩(wěn)定性都優(yōu)于現(xiàn)有的酶聯(lián)免疫分析法和膠體金法，具有廣闊的應(yīng)用前景。本標(biāo)準(zhǔn)旨在建立谷物中黃曲霉毒素B1的時間分辨熒光免疫層析檢測技術(shù)，用于谷物中黃曲霉毒素B1的快速、準(zhǔn)確定量檢測。便于基層糧庫、糧油企業(yè)以及糧食監(jiān)管部門中對谷物中黃曲霉毒素B1的準(zhǔn)確定量和檢測，實現(xiàn)對谷物中黃曲霉毒素B1

6、的有效監(jiān)管。保障糧食的質(zhì)量安全和人民群眾的身體健康，最終實現(xiàn)我國農(nóng)業(yè)等行業(yè)的健康發(fā)展。30、0.35、0.7、1.4、3.5、7、14、35ngmL標(biāo)準(zhǔn)液體加入試紙條加樣孔，10min后用熒光讀取儀檢測試紙條T、C線熒光強(qiáng)度，跟蹤記錄45min內(nèi)試紙條FIT、FIC和FITFIC值變化，具體結(jié)果見下圖，從插圖中可知，AFB1濃度為0pgmL時，隨著反應(yīng)時間的增長，試紙條T、C線熒光強(qiáng)度逐漸增加，直到45min后，T、C線免疫學(xué)反應(yīng)仍然沒

7、有進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)；而從圖可知試紙條FITFIC比值在反應(yīng)10min進(jìn)入了穩(wěn)定狀態(tài)，且隨著AFB1加標(biāo)濃度的增加，F(xiàn)ITFIC越快進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)。以上實驗結(jié)果表明，以FITFIC值為基礎(chǔ)的試紙條定量檢測模型一定程度上可消除試紙條外界環(huán)境的干擾，縮短檢測時間。本實驗最后確定試紙條定量分析的判讀時間為加樣后10min。圖1最佳反應(yīng)時間優(yōu)化2.2.2.22.2.2.2溶液溶液pH對試紙條的影響對試紙條的影響分別調(diào)節(jié)陰性混合樣品至pH5、6、7、8和