質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化(熱激法)

1、實(shí)驗(yàn)四質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)?；蛞运鼮檩d體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)重組克隆的增殖，便于后續(xù)分子操作?？梢圆捎枚喾N方法篩選和鑒定目的克隆。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諢峒しɑ螂娹D(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化子的鑒定方法。實(shí)驗(yàn)材料：外源片段與載體的連接產(chǎn)物；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)原理：（1）熱激法：大腸桿菌在0℃CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基－鈣磷酸復(fù)合

2、物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，重組子基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉(zhuǎn)化子。（2）電轉(zhuǎn)化法：外加于細(xì)胞膜上的電場(chǎng)造成細(xì)胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，不僅有利于離子和水進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，也有利于孔DNA等大分子進(jìn)入。同時(shí)DNA在電場(chǎng)中形成的極性對(duì)于它運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞也是非常重要的。熱激法轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟：1制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化

3、的250mlLB固體培養(yǎng)基中（冷卻止55攝氏度以下）加入Amp至終濃度50μgml，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；2取出1管制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；3每100μl感受態(tài)細(xì)胞加入約20ng質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，在冰上放置30分鐘；4熱擊：將離心管放置42℃水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動(dòng)離心管；5冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，放置1－2分鐘；6復(fù)蘇：每管加400μlLB培養(yǎng)基，在37℃搖床溫和搖動(dòng)溫育45分鐘，使細(xì)菌復(fù)蘇；7布皿：取適當(dāng)

4、體積均勻涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板；8培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)皿，于37℃培養(yǎng)12－16小時(shí)即可觀察到白色的菌落，即為轉(zhuǎn)化子。實(shí)驗(yàn)四質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)?；蛞运鼮檩d體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)重組克隆的增殖，便于后續(xù)分子操作?？梢圆捎枚喾N方法篩選和鑒定目的克隆。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諢峒しɑ螂娹D(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化子的鑒定方法。實(shí)驗(yàn)材料：外源片段與載體的連接產(chǎn)物；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)

5、原理：（1）熱激法：大腸桿菌在0℃CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基－鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，重組子基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉(zhuǎn)化子。（2）電轉(zhuǎn)化法：外加于細(xì)胞膜上的電場(chǎng)造成細(xì)胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，不僅有利于離子和水進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，也有利于孔D

6、NA等大分子進(jìn)入。同時(shí)DNA在電場(chǎng)中形成的極性對(duì)于它運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞也是非常重要的。熱激法轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟：1制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的250mlLB固體培養(yǎng)基中（冷卻止55攝氏度以下）加入Amp至終濃度50μgml，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；2取出1管制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；3每100μl感受態(tài)細(xì)胞加入約20ng質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，在冰上放置30分鐘；4熱擊：將離心管放置42℃水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動(dòng)離心管；5冰鎮(zhèn)：快速將離