第六章 獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)2011

1、第六章 獸藥殘留檢測(cè)技術(shù),第一節(jié) 獸藥殘留,使用獸藥的目的,防治食品動(dòng)物疾病促進(jìn)生長(zhǎng)提高飼料利用率,獸藥的使用情況,據(jù)1966~1974年統(tǒng)計(jì),美國(guó)大約已有78%~80%的食品動(dòng)物,在其一生中或多或少服用過(guò)藥物。,獸藥的殘留,獸藥殘留是指動(dòng)物性產(chǎn)品的任何可食部分含有獸藥母化合物或其代謝物。獸藥最高殘留限量（MRL）：是指某種獸藥而在食物中或食物表面產(chǎn)生的的最高允許獸藥殘留量（單位μg/kg, 以鮮重計(jì)）。獸藥殘留主要是由于各

2、種正常用藥和藥物濫用造成的,另外,休藥期過(guò)短, 是造成動(dòng)物性食品獸藥殘留過(guò)量的另一個(gè)重要原因。休藥期：是指自末次給藥到動(dòng)物允許屠宰或其動(dòng)物性產(chǎn)品（乳、蛋等）獲準(zhǔn)上市的間隔時(shí)間。,獸藥的危害,引起過(guò)敏、致畸、致突變及致癌等不良反應(yīng)。,立法,為防止動(dòng)物性食品中可能出現(xiàn)的藥物殘留損害人體健康,1984年在CAC的倡導(dǎo)下由聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)聯(lián)合發(fā)起組織了食品中獸藥殘留立法委員會(huì)(CCRVDF)。CCRVDF的主

3、要宗旨是:為控制食品中的獸藥殘留,篩選并建立適用于全球的獸藥及其他化學(xué)物殘留的分析方法和取樣方法;對(duì)獸藥殘留進(jìn)行毒理學(xué)評(píng)價(jià);按制訂世界或地區(qū)性法規(guī)標(biāo)準(zhǔn) (Codex Standart)的8個(gè)步驟,制定動(dòng)物組織及產(chǎn)品中獸藥最高殘留限量(MRL)法規(guī)及休藥期法規(guī)。,一、常見(jiàn)獸藥,,,按用途分類,抗微生物藥,抗寄生蟲(chóng)藥,激素類藥物,生長(zhǎng)促進(jìn)劑,,抗菌藥：磺胺藥、呋喃類藥、喹諾酮類,抗病毒藥：干擾素,抗蠕蟲(chóng)藥,抗原蟲(chóng)藥,殺蟲(chóng)藥,,抗生素：青霉素

4、、鏈霉素、氯霉素,1、抗微生物藥,抗微生物藥是指對(duì)病原微生物(細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等)具抑制或殺滅作用,主要有用于全身感染的抗生素、磺胺藥及其他化學(xué)合成抗菌藥。,根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)可分類為:,(1)氨基糖苷類： 鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素、安普霉素等。(2) β-內(nèi)酰胺類： 青霉素、頭孢菌素等。(3)四環(huán)素類： 土霉素、金霉素、多西環(huán)素等。(4)氯霉素類： 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等。 (5)大環(huán)內(nèi)酯類： 紅霉

5、素、吉他霉素、泰樂(lè)菌素等。(6)林可胺類： 林可霉素、克林霉素。(7)多肽類： 桿菌肽、黏菌素等。,,(8)多烯類：兩性霉素、制霉菌素等。(9)磺胺類及抗菌增效劑： 磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺異唑、磺胺甲基異唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶等。(10)硝基呋喃類：呋喃西林、呋喃他酮、呋喃要因、呋喃唑酮等。(11)喹諾酮類：萘啶酸、吡哌酸、嗯喹酸、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、奧比沙星、沙拉沙星、馬波沙星等。,,2、抗寄生蟲(chóng)藥,抗寄生

6、蟲(chóng)藥是指能殺滅或驅(qū)除動(dòng)物體內(nèi)外寄生蟲(chóng)的藥物。畜禽寄生蟲(chóng)病的危害性極大,會(huì)給國(guó)民經(jīng)濟(jì)造成無(wú)法估量的巨大經(jīng)濟(jì)損失。寄生蟲(chóng)病不僅引起大批畜禽死亡,而且嚴(yán)重影響動(dòng)物生長(zhǎng)率,使乳、肉、蛋、毛、革等畜產(chǎn)品質(zhì)量下降,數(shù)量減少。某些人畜共患寄生蟲(chóng)病,還能直接威脅人類的健康和生命安全。,根據(jù)藥物作用的特點(diǎn)，抗寄生蟲(chóng)藥可分為:,(1)抗蠕蟲(chóng)藥： 苯并咪唑類、咪唑并噻唑類、有機(jī)磷酸酯類、四氫嘧啶類、水楊酰苯胺類、阿維菌素類、哌嗪衍生物等。(2

7、)抗原蟲(chóng)藥： 聚醚類離子載體抗生素、三嗪類、二硝基類、氯羥吡啶。(3)殺蟲(chóng)藥： 有機(jī)磷化合物、擬除蟲(chóng)菊酯類化合物等。,,3、激素與其他生長(zhǎng)促進(jìn)劑,(1)性激素動(dòng)物生產(chǎn)中使用的性激素,包括雌性激素(如:雌二醇、己烯雌酚(己烷雌酚、甲地孕酮、雌烯酮等)和雄性激素(如:甲基睪丸酮、丙酸睪酮、氯睪酮)。(2)生長(zhǎng)激素 是由動(dòng)物腦垂體分泌的天然蛋白質(zhì)激素,主要通過(guò)促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和脂肪分解來(lái)促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng),增加瘦肉率,提高飼

8、料轉(zhuǎn)化率。目前在畜牧業(yè)生產(chǎn)中使用的主要有牛生長(zhǎng)激素(BST)和豬生長(zhǎng)激素(PST)。,,(3)甲狀腺素,類甲狀腺素及抗甲狀腺素。(4)人工合成的蛋白質(zhì)同化激素 人工合成的蛋白質(zhì)同化激素可促進(jìn)動(dòng)物腦下垂體生長(zhǎng)激素的分泌。與抗生素一樣,伴隨著激素活性物質(zhì)在畜禽生產(chǎn)中的使用種類和數(shù)量的不斷增加,反對(duì)使用的呼聲也越來(lái)越高。(5)鎮(zhèn)靜劑和β-腎上腺素阻斷劑 為了控制被運(yùn)輸及等待屠宰的動(dòng)物的緊張,有些畜牧業(yè)會(huì)非法使用鎮(zhèn)靜劑和腎上腺素阻

9、滯劑。因?yàn)樨i對(duì)于它們所處環(huán)境的突然變化特別敏感,隨之產(chǎn)生的新陳代謝和緊張會(huì)影響肉的質(zhì)量。,二、常見(jiàn)獸藥殘留的種類與危害 1. 抗生素類藥物,多為天然發(fā)酵產(chǎn)物, 是臨床應(yīng)用最多的一類抗菌藥物, 如青霉素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、螺旋霉素、鏈霉素、土霉素、金霉素等。,2. 磺胺類藥物,主用于抗菌消炎, 如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶, 磺胺瞇, 菌得清、新諾明等。近年來(lái), 磺胺類藥物在動(dòng)物性食品中的殘留超標(biāo)現(xiàn)象, 在所有獸藥當(dāng)中是

10、最嚴(yán)重的。,3. 硝基呋喃類藥物,主用于抗菌消炎, 如呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。,4. 抗寄生蟲(chóng)類藥物,主要用于驅(qū)蟲(chóng)或殺蟲(chóng), 如苯并咪唑、左旋咪唑、克球酚、吡喹酮等。而常用的苯并咪唑類抗寄生蟲(chóng)藥物有丙硫苯咪唑、丙氧咪唑、噻苯咪唑、甲苯咪唑、丁苯咪唑等。,5. 激素類藥物,主要用于提高動(dòng)物的繁殖和加快生長(zhǎng)發(fā)育速度, 使用于動(dòng)物的激素有性激素和皮質(zhì)激素。而以性激素(包括多種內(nèi)源性性激素、人工合成的類似性激素的類固醇化合物、人工合成的

11、具有性激素某些特性的非類固醇化合物) 最常用, 如孕酮、睪酮、雌二醇、甲基睪酮, 丙酸睪酮、苯甲酸雌二醇、己烯孕酮等。,二、食物中獸藥殘留,(1)獸藥殘留獸藥殘留是指動(dòng)物產(chǎn)品的任何食用部分所含獸藥的母體化合物及其代謝物，以及與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)的殘留。,(2)獸藥殘留的來(lái)源,在食品動(dòng)物體內(nèi)或動(dòng)物性食品中發(fā)現(xiàn)的違章殘留,大都是由用藥錯(cuò)誤造成的,其原因主要有:①不正確地應(yīng)用藥物,如用藥劑量、給藥途徑、用藥部位和用藥動(dòng)物的種類等不符合用藥指示

12、,這些因素有可能延長(zhǎng)藥物殘留在體內(nèi)的時(shí)間,從而需要增加休藥的天數(shù);②在休藥期結(jié)束前屠宰動(dòng)物;③屠宰前用藥掩飾臨床癥狀,以逃避屠宰前檢查;④ 以未經(jīng)批準(zhǔn)藥物作為添加劑飼喂動(dòng)物;,,⑤藥物標(biāo)簽上的用法指示不當(dāng),造成違章殘留物;⑥飼料粉碎設(shè)備受污染或?qū)⑹⑦^(guò)抗菌藥物的容器用于貯藏飼料;⑦接觸廄舍糞尿池中含有抗生素等藥物的廢水和排放的污水(如豬經(jīng)常攝入這種污水);⑧任意以抗生素藥渣喂豬或其他食品動(dòng)物等濫用抗生素,是出現(xiàn)抗生素殘留的主要

13、原因。,(3)獸藥殘留的種類(形式),第一類是以游離或結(jié)合形式存在的原藥及其主要代謝物(除高親脂性化合物外),因代謝和排泄迅速,不會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)蓄積。但這些物質(zhì)可能具有毒性作用,而且被人攝入后在體內(nèi)可生成高度活化的中間產(chǎn)物(親電子基團(tuán)、自由基等),因而對(duì)消費(fèi)者具有潛在的危害性。第二類是共價(jià)結(jié)合代謝物,因其從機(jī)體排出相對(duì)較慢,它們的存在對(duì)于靶動(dòng)物有潛在的毒性作用,而對(duì)于消費(fèi)者,由于結(jié)合殘留在人體內(nèi)不可能再活化,其生物利用率和含量均低,可能

14、只顯示很低的毒性。,,殘留毒理學(xué)意義較大的獸藥按其用途分類主要包括:抗生素類、合成抗菌素類、抗寄生蟲(chóng)類藥、生長(zhǎng)促進(jìn)劑和殺蟲(chóng)劑等。抗生素和抗菌素統(tǒng)稱抗微生物藥物,是最主要的獸藥添加劑和獸藥殘留,約占藥物添加劑的60%。,(4)影響食品動(dòng)物組織中藥物殘留的因素,經(jīng)內(nèi)服或注射給藥的動(dòng)物,其組織中存在的藥物及其代謝物或降解產(chǎn)物的殘留。組織中藥物殘留隨藥物種類、劑量、給藥途徑、藥物及其代謝物特性的不同而異。在有些情況下,飼料也會(huì)影響動(dòng)物組

15、織中的藥物殘留,但藥物休藥期的執(zhí)行情況是影響組織殘留的最重要因素。屠宰后胴體加工過(guò)程也是影響藥物殘留檢出率的因素之一。烹調(diào)和貯藏溫度亦影響殘留藥物在組織中的穩(wěn)定性。,,對(duì)于大多數(shù)抗微生物藥來(lái)說(shuō),藥物從動(dòng)物體內(nèi)消除屬一級(jí)動(dòng)力學(xué),而大多數(shù)組織中藥物殘留抗微生物活性的喪失是一個(gè)零級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程。這表示藥物殘留量越多,它們從食用組織中消除所需的時(shí)間就越長(zhǎng)。如果藥物添加劑是親脂性的,那么它們會(huì)蓄積在脂肪組織中,而且其消除速度明顯比親水性藥物慢

16、。實(shí)際上,存在于家禽食用組織、牛肉、羊肉、乳和蛋中的藥物殘留的種類和發(fā)生率差異較大。這是動(dòng)物屠宰前或其乳和蛋上市前停止用藥時(shí)間長(zhǎng)短的一種反映。,四、獸藥殘留的現(xiàn)狀與法規(guī),獸藥殘留主要是由于不合理使用藥物治療動(dòng)物疾病和作為飼料藥物添加劑而引起的。1990年出口日本的1萬(wàn)噸肉雞,由于檢測(cè)出抗球蟲(chóng)藥氯羥吡啶的殘留量超標(biāo),要求我國(guó)政府銷毀所有產(chǎn)品,給我國(guó)造成很大經(jīng)濟(jì)損失。出口到德國(guó)的蜂蜜由于農(nóng)藥“殺蟲(chóng)脒”殘留超標(biāo)而被退貨,接著歐共體、美國(guó)

17、、日本也相繼拒絕進(jìn)口我國(guó)蜂蜜,使我國(guó)蜂蜜在世界市場(chǎng)上的銷售發(fā)生嚴(yán)重因難。1998年4月,從內(nèi)地出口到香港的生豬,其內(nèi)臟食后導(dǎo)致17人中毒。其原因是內(nèi)臟中含有違禁藥“鹽酸克侖特羅”。此外,我國(guó)出口的畜禽產(chǎn)品還多次出現(xiàn)安眠酮類、雌性激素、抗生素等藥物殘留超標(biāo)而被取消出口的事件。,,1995年、1996年,歐盟獸醫(yī)委員會(huì)派員對(duì)我國(guó)進(jìn)行了考察和評(píng)估,認(rèn)為我國(guó)的獸醫(yī)衛(wèi)生狀況達(dá)不到歐盟的要求,于是做出了從1996年8月1日起,禁止從我國(guó)進(jìn)口禽肉

18、的決定。1997年、1998年歐盟又派員來(lái)華考察,結(jié)果仍達(dá)不到其要求。目前,我國(guó)肉、蛋、奶的出口形勢(shì)仍相當(dāng)嚴(yán)峻。我國(guó)已開(kāi)始重視動(dòng)物性食品中的獸藥殘留問(wèn)題,制訂了各種獸藥殘留的法律和法規(guī),修訂了《動(dòng)物性食品中獸藥殘留最高限量標(biāo)準(zhǔn)》,并開(kāi)始建立了全國(guó)范圍的獸藥殘留監(jiān)控體系。,,,第六章 獸藥殘留檢測(cè)技術(shù),第二節(jié) 樣品前處理,,樣品前處理是指樣品的制備和對(duì)樣品中的待測(cè)組分進(jìn)行提取、凈化、濃縮的過(guò)程。樣品前處理的目的是消除基質(zhì)干擾、保

19、護(hù)儀器、提高檢測(cè)方法的靈敏度、選擇性、準(zhǔn)確度、精密度。不同樣品前處理方法的選擇，需要根據(jù)樣品中危害殘留物質(zhì)的特點(diǎn)。殘留分析中的樣品主要是各種食用組織(肌肉、脂肪、肝、腎、皮、血液、蛋、奶及其加工食品)?；铙w檢測(cè)中一般采集血漿、尿液和糞便;屠宰場(chǎng)主要采集某種藥物的靶組織及其他高濃度的樣本,如肝、腎、膽汁、注射部位的組織等。,一、生物樣品的類型,獸藥殘留分析中,最常用的生物樣品是組織樣品,其次是奶、血液和尿液樣品。(1)動(dòng)物組織

20、肌肉(除去可見(jiàn)的脂肪)中水分約占75%,蛋白質(zhì)(肌漿蛋白、肌原蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白)占19.0%、脂肪(中性脂肪、脂肪酸和磷脂)占2.5%、糖類1.2%,以及一些無(wú)機(jī)鹽、維生素和酶類。肌漿蛋白(肌紅蛋白、糖解酶)可溶于水,肌原蛋白(肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白)溶于濃鹽水,膠原蛋白和彈性蛋白(結(jié)締組織)在上述溶劑中均不溶。,,不同種類動(dòng)物的食物構(gòu)成和肌肉的成分,如家禽和牛的肌紅蛋白和脂肪含量存在差異,這些變化會(huì)影響分析方法的回收率或干擾檢

21、測(cè),因此一種動(dòng)物組織的殘留分析方法對(duì)其他動(dòng)物組織樣品不一定適用。例如,用水提取雞肉和牛肉組織中呋喃唑酮,回收率在75%以上;同樣的方法提取豬肌肉樣品,回收率僅為10%,改用25%乙腈提取時(shí)回收率明顯提高,推測(cè)呋喃唑酮與豬肉中某種蛋白質(zhì)結(jié)合較強(qiáng)。肝或腎組織為代謝或排泄器官,殘留物濃度高,消除緩慢,因此常被作為殘留檢測(cè)的靶組織。,(2)尿樣,尿液的主要成分是水、尿素及鹽類。它是一種良好的細(xì)菌培養(yǎng)基,因而需立即冷藏或防腐處理。冷藏條件一

22、般可置4℃ 冰箱內(nèi)。若欲在室溫下保存,應(yīng)在收集尿樣后,立即加入防腐劑。常用的防腐劑有甲苯、氯仿或改變尿液的酸堿性,以抑制細(xì)菌的繁殖。加入的防腐劑是否干擾測(cè)定或與被測(cè)組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng),應(yīng)由實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,以便選取合適的防腐措施。,,在所有體液樣品中,尿樣最容易獲得,并且樣品量多,內(nèi)含藥物(母體藥物及代謝物)濃度高;正常尿液中僅含微量蛋白質(zhì),不需去蛋白處理。尿中藥物大多呈結(jié)合狀態(tài),主要以葡萄苷酸和硫酸酯結(jié)合物存在,因此無(wú)論直接測(cè)定或萃取分離

23、之前,都必須將結(jié)合態(tài)的藥物水解,使藥物游離出來(lái)。尿樣pH變化范圍大,分析前需調(diào)節(jié)到一致的pH值。,(3)血樣,血液采集好之后,由于激活了一系列凝血因子,血中的纖維蛋白原形成纖維蛋白,血液逐漸凝固,上層析出澄清的黃色液體稱為血清(serum)。分離血清時(shí),可將凝結(jié)后的血液置離心機(jī)中離心,將上層血清轉(zhuǎn)入另外容器中保存,得到的血清,一般可占全血量的40%左右。,,若采血后立即將血液轉(zhuǎn)入有抗凝劑(常用肝素)的容器中,并輕輕搖勻,則血液不再凝

24、結(jié),放置后血細(xì)胞會(huì)緩緩沉降,1~2h沉降完全,上層的黃色液體稱為血漿(plasma)。離心使上層血漿與下層血細(xì)胞充分分離,將血漿轉(zhuǎn)移至另一容器內(nèi)供分析。血液通過(guò)抗凝獲得的血漿量,一般比血清稍多,接近全血量的50%。,,,,若抗凝血不離心,保持血漿和血細(xì)胞混合在一起,則稱為全血(whole blood)。全血樣品可冷凍貯存或直接供分析。全血樣品放置或自貯存處取出解凍之后,可明顯分為上、下兩層,上層為血漿,下層為血細(xì)胞,但輕微搖動(dòng)即

25、可混勻。血漿和血清的化學(xué)成分與組織液相近,測(cè)定血漿或血清中藥物濃度,比全血更能反映作用部位藥濃的變化,測(cè)定方法一般也可互相通用。因?yàn)閺目鼓苽溲獫{的速度較快,并且分離出的血漿量比血清多,所以應(yīng)用血漿比較方便;若血漿中含有抗凝劑對(duì)測(cè)定有影響,則應(yīng)使用血清樣品。,,通常藥物在血漿中均與血漿蛋白(白蛋白、球蛋白、糖蛋白、脂蛋白)發(fā)生一定程度的結(jié)合,一些藥物甚至蛋白結(jié)合率可達(dá)90%以上。因此在萃取之前,必須將結(jié)合態(tài)的藥物游離出來(lái)。,(4)奶

26、樣,牛奶的含水量約87%,蛋白質(zhì)(以酪蛋白為主)為3.3%,脂肪(甘油三酯)為3.7%,糖類(乳糖)為4.7%,以及一些無(wú)機(jī)鹽、維生素和酶類(過(guò)氧化物酶、脂肪酶等)。奶是一種復(fù)雜的非均相體系。乳脂球的主要成分為乳脂,表面包以由酪蛋白、類脂、酶、無(wú)機(jī)鹽和水分構(gòu)成膜,使乳球能穩(wěn)定地懸浮在奶中并保護(hù)內(nèi)部的乳脂免遭脂肪酶的水解,當(dāng)劇烈振蕩時(shí)球膜被破壞,脂肪球即相互黏合析出。奶中還含有大量由酪蛋白或脂蛋白構(gòu)成的膠束體系,當(dāng)酸化或加熱時(shí),膠束

27、結(jié)構(gòu)解體,蛋白質(zhì)沉淀析出。,,非解離性的或極性較低的藥物易由血漿向奶中擴(kuò)散,導(dǎo)致奶中殘留。與血漿樣品類似,奶中的藥物可與蛋白質(zhì)結(jié)合。因此在萃取之前,必須將結(jié)合態(tài)的藥物游離出來(lái)。,(5)蛋,禽蛋包括蛋黃和蛋清。蛋黃的含水量約50%、蛋白質(zhì)16.5%、脂肪33%、糖類0.2%,以及一些無(wú)機(jī)鹽、維生素和酶類(淀粉酶、脂肪酶、磷酸酶、肽酶和過(guò)氧化氫酶)蛋清含水量達(dá)88%,蛋白質(zhì)10.5%和極少量的碳水化合物和脂肪。與蛋清相比較,蛋黃基

28、本上為疏水性環(huán)境,低極性藥物的殘留較多。,,如果需要分別測(cè)定蛋黃和蛋清中的殘留,最好將剛產(chǎn)出后的蛋分離蛋黃和蛋清,避免藥物由蛋黃向蛋清擴(kuò)散。與尿液類似,蛋成分的pH變化范圍大,分析前需調(diào)節(jié)pH值。,二、樣品制備和貯存,樣品的制備方法，依據(jù)法規(guī)要求的不同和食品本身特性的差異而不同。有的要以全樣計(jì),有的以脂肪計(jì)。一般來(lái)說(shuō)是取可食部分制備樣品(除非有其他要求)。如對(duì)于肉類有的國(guó)家法枧規(guī)定要以脂肪計(jì)算食品安全危害物的量,有的要求以全樣來(lái)計(jì)

29、算。,,為保證取樣的準(zhǔn)確性、減少污染和便于保存,對(duì)組織樣品宜分取一個(gè)完整解剖部分,如一個(gè)肝葉或一側(cè)完整的腎,小動(dòng)物應(yīng)摘取完整的臟器,并立即密封。樣品被絞碎或勻漿后進(jìn)行縮分。生物樣品采樣后除立即分析外,都需要在適當(dāng)條件下保存,目的是避免被測(cè)組分發(fā)生分解或產(chǎn)生其他化學(xué)變化。,貯存,冷凍保存是最常用的方法,一般冷凍溫度為-20℃,此時(shí)生物樣品如血漿、尿液和組織樣品均被凍凝,可以終止樣品中酶的活性,又可以貯存樣品。在某些情況下若收集的樣品來(lái)

30、不及冷凍處理,可先將其置冰屑中,然后再行冷凍貯存,臨用前再融化并放至室溫后供測(cè)定。,,對(duì)于一些易代謝的藥物,如磺胺類、聚醚類、同化激素,它們的肝和腎臟樣品不宜長(zhǎng)期存放,理想的冷凍溫度應(yīng)為-40℃~-80℃ 。為防止含酶樣品中被測(cè)組分進(jìn)一步代謝,采樣后必須立即終止酶的活性。常采用的方法有:液氮中快速冷凍、微波照射、勻漿及沉淀、加入酶活性阻斷劑(通常加入氟化鈉)等。某些生物樣品中的藥物易被空氣氧化,如兒茶酚類中的阿樸嗎啡,具有鄰苯二酚結(jié)

31、構(gòu),易被空氣氧化產(chǎn)生醌類雜質(zhì),若收集的血漿樣品不加抗氧劑直接在-15℃ 冷藏,僅能穩(wěn)定4周;但加入抗壞血酸后,則可穩(wěn)定10周。,,冷凍時(shí),若使用玻璃容器貯存樣品,需注意防止溫度驟降使容器破裂,造成樣品損失或污染。而塑料容器常含有高沸點(diǎn)的增塑劑,可能釋放到樣品中造成污染,而且還會(huì)吸留某些藥物,引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物還會(huì)被玻璃容器表面吸附,影響樣品中藥物的定量回收,因此,必要時(shí)應(yīng)將玻璃容器進(jìn)行硅烷化處理。,三、樣品均勻化,對(duì)

32、于血漿、奶、尿液樣品,可置渦旋混合器上混勻,以免造成測(cè)定誤差。對(duì)于肌肉、組織、糞便等半固體樣品都存在均勻化這一問(wèn)題。其中肌肉和組織樣品可置勻漿機(jī)中均質(zhì),糞便樣品可加入少量甲醇或其他液體攪勻。同時(shí)還應(yīng)注意取樣的代表性問(wèn)題。,四、去蛋白處理,生物樣品如肝臟、腎臟、血漿等含有大量的蛋白質(zhì),它們能結(jié)合藥物,因此對(duì)于某些藥物的測(cè)定,必須先將與蛋白結(jié)合的藥物游離之后再作進(jìn)一步處理。為什么要除去蛋白？？因?yàn)樯飿悠泛写罅康牡鞍踪|(zhì),蛋白質(zhì)在

33、測(cè)定過(guò)程中會(huì)形成泡沫、渾濁或出現(xiàn)沉淀而干擾測(cè)定。蛋白質(zhì)還會(huì)污染儀器或惡化測(cè)定條件,如直接進(jìn)樣用液相色譜分析含蛋白質(zhì)的體液樣品時(shí),蛋白質(zhì)會(huì)沉積在色譜柱上,這不僅影響柱效,而且大大縮短色譜柱的使用壽命。目前已有很多去蛋白方法可供使用,但使用各種方法之前應(yīng)了解該方法是否會(huì)導(dǎo)致生物樣品中的藥物發(fā)生分解或影響藥物的提取等。,,注意方法選擇,,通常去蛋白過(guò)程是將蛋白質(zhì)變性處理后,把與蛋白結(jié)合的藥物解離出來(lái),離心分離以除去蛋白。通常除蛋白的方法是

34、在含蛋白樣品中加入適當(dāng)?shù)某恋韯┗蜃冃詣?使蛋白質(zhì)脫水而沉淀(如有機(jī)溶劑、中性鹽),有的是由于蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而析出(如一些酸類:三氯醋酸、高氯酸、磷酸、苦味酸),離心后取上清液用于分析。,1、有機(jī)溶劑沉淀,甲醇、乙腈、丙酮和乙醇是沉淀蛋白常用的有機(jī)溶劑,尤以甲醇和乙腈為最常用。甲醇與蛋白形成絮狀沉淀易于離心分離,得到澄清的上清液;乙腈與蛋白形成致密沉淀,易離心除去,沉淀效率較甲醇高。使用時(shí)應(yīng)加入足量的沉淀劑,通常加入量為樣品體積

35、的1.5~2倍。,2、酸性沉淀,常用的酸性沉淀劑有三氯醋酸和高氯酸,其他還有鎢酸、鉬酸、磷鎢酸、磷鉬酸和苦味酸等。酸性沉淀劑能同蛋白質(zhì)的陽(yáng)離子形成不溶鹽而沉淀,必要條件是溶液的pH要低于蛋白的等電點(diǎn)。加入沉淀劑之后立即形成白色沉淀(必要時(shí)可加熱使沉淀完全),離心后可得到澄明的上清液。,,三氯醋酸(常用10%溶液)沉淀蛋白的作用很強(qiáng),因此最常使用,但應(yīng)注意試劑中含有的雜質(zhì),將它們引入離心后的上清液中,可能會(huì)干擾藥物的分析。其次應(yīng)注意

36、,當(dāng)上清液再用乙醚等有機(jī)溶劑萃取時(shí),三氯醋酸則連同溶入其內(nèi)的雜質(zhì)會(huì)進(jìn)入有機(jī)相,也可能干擾藥物的分析。采用高氯酸作為蛋白沉淀劑時(shí),其優(yōu)點(diǎn)是殘留在上清液中的ClO4-可加入鉀鹽除去。,3、無(wú)機(jī)鹽沉淀,一些無(wú)機(jī)鹽如硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等,能使蛋白質(zhì)膠體脫水并中和其電荷,使蛋白質(zhì)失去膠體性質(zhì)而沉淀下來(lái)。無(wú)機(jī)鹽中以硫酸銨最常用。常用的重金屬鹽類有汞鹽、銅鹽和鋅鹽等,它們能與蛋白質(zhì)形成不溶鹽而沉淀析出。如可用HgCl2作為蛋白沉淀劑處理血

37、漿樣品,離心后用比色法測(cè)定上清液中的水楊酸濃度。采用蛋白沉淀劑,只要加入足量,一般可除去98%以上的蛋白。蛋白沉淀后是否與之相結(jié)合的藥物能游離釋出,目前尚缺乏系統(tǒng)的研究資料,僅觀察到少數(shù)現(xiàn)象。,4、透析法,透析法與超濾法也是除去樣品中蛋白的方法。透析法很費(fèi)時(shí),溶質(zhì)透過(guò)膜的程度與被測(cè)物的性質(zhì)、溫度有關(guān),膜需常常更新,很難自動(dòng)化,因此透析法一般不用于常規(guī)分析,而用于藥物在生物樣品中蛋白結(jié)合率的研究。,5、超濾法,超濾法是另一種除去樣品中

38、蛋白和其他大分子的方法,也是一種薄膜分離技術(shù)。與蛋白沉淀法相比,其優(yōu)點(diǎn)是適用于小量樣品,不稀釋試樣,也不改變?cè)嚇拥膒H,尤其適于含對(duì)酸堿不穩(wěn)定的化合物的樣品,用于樣品的濃縮、脫鹽、不同分子尺寸的分離。如果待測(cè)物易被某種酶分解,那么超濾除去該酶后就避免了待測(cè)物的分解。在殘留分析中超濾法常用于牛奶、血液中游離藥物濃度和藥物-血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定。超濾法的缺點(diǎn)是待測(cè)物可能被結(jié)合在濾膜上而影響回收率,而且一些能與大分子蛋白結(jié)合的藥物也會(huì)隨

39、著蛋白質(zhì)被除去而丟失。,五、冷凍干燥,冷凍干燥是貯存和預(yù)處理某些生物樣品的有效方法,適合于處理量大的樣品。例如,一些樣品中所含藥物水溶性很強(qiáng)(不容易被有機(jī)溶劑萃取),可凍干后再進(jìn)行液-固萃取。凍干法也適用于一些含揮發(fā)性藥物的樣品以及對(duì)熱不穩(wěn)定的樣品。此外,還有一些生物樣品中的藥物需進(jìn)行衍生化,若采用常規(guī)的液-液萃取,在一定溫度下?lián)]發(fā)去有機(jī)溶劑后再進(jìn)行衍生化,則在加熱過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致藥物分解或隨溶劑一起揮發(fā),因此也宜將這些樣品經(jīng)凍干處理

40、后再行衍生化。,,生物樣品凍干時(shí),可先將其置干冰-丙酮浴中、液氮中或其他低溫條件下,半固體樣品如糞便、組織等冷凍時(shí)間約1~10min。冷凍后水分在樣品表面形成“冰殼”,增加了揮發(fā)面積,再將其放入凍干機(jī)內(nèi)減壓,冰則直接升華,和其他揮發(fā)性雜質(zhì)一起被除去,使樣品干燥。凍干后的樣品通?？芍苯蛹尤胗袡C(jī)溶劑萃取。凍干時(shí)應(yīng)注意某些揮發(fā)性強(qiáng)的藥物可能揮發(fā)損失。,操作步驟,六、結(jié)合物水解,以結(jié)合狀態(tài)存在的藥物大多存在于尿中,但也存在于肝臟和血液中。常

41、用的結(jié)合物水解的方法有:(1)酸水解酸水解通常使用無(wú)機(jī)酸,如尿樣中結(jié)合物水解可加入適量的鹽酸液。加入鹽酸的濃度、酸化時(shí)間以及是否需要加熱等,隨藥物而異,但最終應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。水解后的樣品呈強(qiáng)酸性,必要時(shí)可用堿液調(diào)整pH后再進(jìn)行萃取。,藥物在體內(nèi)經(jīng)代謝反應(yīng)之后,形成葡糖苷酸及硫酸酯等結(jié)合物,(2)酶水解,酶水解是專一性很強(qiáng)的水解結(jié)合物的方法。通常使用的水解酶是β-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可專門水解藥物的葡萄糖醛酸苷,后者水

42、解藥物的硫酸酯。也可用兩者的混合物,將生物樣品中藥物的葡萄糖醛酸苷及硫酸酯同時(shí)水解。尿液中通常存在以上兩種結(jié)合物,因此混合酶水解法具有實(shí)用價(jià)值。,(3)溶劑解,某些藥物或內(nèi)源化合物的硫酸酯,可隨加入的萃取溶劑,在萃取過(guò)程中發(fā)生分解,通常稱為溶劑解。溶劑解也是分解結(jié)合物較溫和的一種方法。,七、樣品提取和凈化,1、液-液萃取液-液萃取是經(jīng)典的提取方法之一,它基于被測(cè)組分在不相溶的兩種溶劑中的分配。與其他方法相比,液-液萃取法仍是目

43、前最常用的樣品處理方法,其原因是:①通過(guò)萃取可將被測(cè)組分自大量?jī)?nèi)源性物質(zhì)中分離出來(lái),減少雜質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾;②操作簡(jiǎn)單快速、經(jīng)濟(jì)實(shí)用;③可將萃取液蒸發(fā),使組分富集;④可一次進(jìn)行同類組分的萃取。,提取→凈化→濃縮→色譜分析,液-液萃取的溶劑選擇,液-液萃取常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、苯、甲苯、正己烷。溶劑選擇應(yīng)注意以下幾點(diǎn):①溶劑的極性，根據(jù)相似相溶原理,極性組分易溶于

44、極性溶劑,反之亦然,應(yīng)根據(jù)被測(cè)組分的極性選擇相似極性的溶劑。實(shí)際萃取被測(cè)組分時(shí),還常于萃取溶劑中加人第二種溶劑,以調(diào)整極性,使達(dá)到選擇性萃取。,,②溶劑的沸點(diǎn)，萃取分離后的有機(jī)相通常需置溫水浴中通壓縮空氣(或氮?dú)?使揮發(fā),將被測(cè)組分濃集,因此萃取溶劑的沸點(diǎn)就不應(yīng)接近或高于水的沸點(diǎn),否則揮發(fā)困難。③溶劑的毒性，使用對(duì)人體有害的溶劑萃取時(shí),應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。在常用溶劑中,乙酸乙酯既安全又無(wú)毒,對(duì)不同極性的被測(cè)組分均有較高的萃取回收率,

45、又易于揮發(fā),萃取物中混入的內(nèi)源雜質(zhì)量少,是較理想的首選溶劑。,,④溶劑與水的互溶性有的溶劑如乙醚,萃取后可混入大約1.2%的水分,因此伴隨帶入一些水溶性雜質(zhì)。乙醚萃取能力強(qiáng),又易于揮發(fā)濃縮,為常用萃取溶劑,除去混入水分的方法是加入無(wú)水Na2SO4脫水,減少混入的水溶性雜質(zhì)量。萃取時(shí)于水相中加入有機(jī)相后,一般只萃取一次。特殊情況下(如雜質(zhì)不易除去),則必須將第一次萃取分出的含藥有機(jī)相,再用一定pH的水溶液反萃取,最后再?gòu)乃鄬⑺幬镙?/p>

46、回到有機(jī)相中。,萃取溶劑與水的比例,萃取過(guò)程中加入的有機(jī)溶劑并非越多越好,而應(yīng)適量。一般有機(jī)相與水相容積比以1:1或2:1為佳,據(jù)被測(cè)組分的性質(zhì)及方法需要,有時(shí)也增加有機(jī)相的比例。另外,萃取時(shí)若往水相中加入少量比重大的有機(jī)溶劑(如氯仿),而該溶劑對(duì)藥物的溶解度又比較大,則可將藥物從水相中濃集于小體積的有機(jī)相中,若萃取時(shí)使用的是尖底試管,則富含藥物的有機(jī)相沉積于管尖部位,可直接取樣分析,或?qū)⑵浞蛛x出來(lái)。,離子對(duì)試劑,一些酸性或堿性較強(qiáng)

47、的有機(jī)藥物在體液中呈離解狀態(tài),成為親水性極強(qiáng)的帶電荷離子,即使控制pH也不能抑制它們的電離,不能用有機(jī)溶劑將其自體液中提取出來(lái)。對(duì)于上述呈離解狀態(tài)的藥物,可加入離子對(duì)試劑,使它們形成具有一定脂溶性的離子對(duì)絡(luò)合物,用有機(jī)溶劑將其從水相中萃取出來(lái)。陽(yáng)離子藥物配對(duì)的離子對(duì)試劑則為陰離子,其中以烷基磺酸鹽類(RSO3H)為最常用。,,陰離子藥物配對(duì)的離子對(duì)試劑主要為烷基季銨類化合物,可用通式R4N+· X-表示,X-可為酸根或氫氧

48、基,R為烷基。烷基碳鏈長(zhǎng)度常用C4~C12,甚至可選用C20,碳鏈越長(zhǎng)，則生成的離子對(duì)絡(luò)合物脂溶性越高。常用的烷基季銨中有四丁基銨、四戊基銨等,商品試劑常用其鹽,如磷酸四丁基銨、硫酸氫四丁基銨,或?yàn)槠錃溲趸瘔A,如氫氧化四丁基銨。,注意事項(xiàng)：,液-液提取有時(shí)會(huì)發(fā)生乳化現(xiàn)象以及被測(cè)組分損失。為了防止乳化,可應(yīng)用較大體積的有機(jī)溶劑,避免猛烈振搖或加入適當(dāng)?shù)脑噭└淖兤浔砻鎻埩Χ迫?若已發(fā)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象,可將試管置于冰箱中冷凍破乳。萃取

49、過(guò)程中所用的玻璃容器壁對(duì)某些藥物的吸附是不可忽略的,特別是當(dāng)藥物濃度較低時(shí)更是如此。除對(duì)萃取所用的器具進(jìn)行硅烷化處理以外,還常在萃取劑中加入異戊醇。異戊醇能減少玻璃壁的吸附,還可減少萃取過(guò)程中乳化的形成。也可以加入二乙胺,二乙胺能顯著減少吸附作用,提高萃取回收率。,2、固相萃取(SPE),固相萃取法(Solid phase extraction,SPE)是近十幾年迅速發(fā)展起來(lái)的一種樣品預(yù)處理技術(shù),它是以液相色譜分離機(jī)制為基礎(chǔ)建立起來(lái)的分

50、離和純化方法。固相分離有兩種實(shí)現(xiàn)樣品純化的途徑。一種是保留雜質(zhì),待測(cè)組分不被保留而自然流出或者被洗脫;更為常用的一種途徑是先使待測(cè)物完全保留在柱上,使干擾雜質(zhì)隨樣品溶劑或洗滌液洗出,然后以小體積溶劑洗脫待測(cè)物。,優(yōu)點(diǎn)：,與經(jīng)典的液-液萃取法相比,固相萃取的優(yōu)點(diǎn)有:①快速,一般l~2min即可完成;②回收率高,通常超過(guò)90%;③精密度比較好;④樣品用量少,有一定的選擇性,無(wú)乳化現(xiàn)象等。,SPE柱,SPE柱可以是一個(gè)玻璃(或塑料)

51、小柱,裝入適當(dāng)?shù)奶盍?固相提取劑),自制的固相萃取柱填充疏松,溶劑能自然流出?，F(xiàn)在已經(jīng)有許多不同形式的商品化固相萃取柱,大多數(shù)商品化柱都是聚丙烯管型柱,底部壓縮裝入100~500mg的填料。使用時(shí)將液體樣品從柱上口加入,樣液通過(guò)固相萃取柱下端流出,液體樣品通過(guò)柱子時(shí)必須施加外力,可在柱下端出口處減壓,或于柱上口加壓,使樣液通過(guò)柱床,柱下端流出液可用另一支試管收集。,固相萃取裝置和操作過(guò)程,,SPE采用的固定相與液相色譜常用的固定相類

52、型相同,常用的固定相有活性炭、硅膠、氧化鋁等吸附劑、高分子大孔樹(shù)脂、離子交換樹(shù)脂和鍵合硅膠等。鍵合硅膠固相提取的一般操作步驟如下:① 以適當(dāng)強(qiáng)溶劑濕潤(rùn)固相萃取柱使其溶劑化;②以弱溶劑通常是水或緩沖溶液洗滌固定相,使其達(dá)到良好的分離狀態(tài);③將溶于弱溶劑常是緩沖溶液中的樣品加到固相提取柱上;④以強(qiáng)度適當(dāng)?shù)娜跞軇?如含有少量甲醇的水或緩沖溶液洗滌、除去基質(zhì)或干擾組分;⑤用強(qiáng)度較高的溶劑洗脫待測(cè)組分,收集洗脫液,直接或適當(dāng)濃縮后進(jìn)行

53、色譜分析。,選擇SPE柱,選擇SPE固定相時(shí),主要依據(jù)兩個(gè)因素:需要提取的溶質(zhì)和樣品溶劑。（1）溶質(zhì)的極性：分析物的極性與固定相極性非常相似時(shí)得到分析物的最佳保留。兩者極性越相似保留越好以要盡量選擇極性相似的固定相。例如萃取碳?xì)浠衔铮ǚ菢O性）要采用反相柱（非極性）。 當(dāng)分析物極性適中時(shí)、反相固定相都可使用。,（2）溶劑強(qiáng)度,固定相選擇還受樣品溶劑強(qiáng)度的制約。樣品溶劑強(qiáng)度相對(duì)該固定相應(yīng)該較弱溶劑會(huì)增強(qiáng)分析物在吸附劑上的保留。如

54、果溶劑太強(qiáng)得不到保留或保留很弱。舉例：樣品的溶劑是正己烷時(shí)，反相柱就不合適，因?yàn)檎和槭菑?qiáng)溶劑，分析物不會(huì)有保留；當(dāng)樣品溶劑是水時(shí)，可以用反相柱，因?yàn)樗侨跞軇?，不影響分析物的保留?（3）其他因素,其他還應(yīng)該考慮以下幾點(diǎn)：①分析物在極性或非極性溶劑中的溶解度；②分析物有無(wú)可能離子化，從而決定可否用離子交換固定相；③分析物有無(wú)可能與固定相形成共價(jià)鍵；④不要的組分與分析物在固定相結(jié)合點(diǎn)上的競(jìng)爭(zhēng)程度。,3、基質(zhì)固相分散技術(shù)（MSP

55、D）,基本操作：將樣品 (固態(tài)或液態(tài))直接與適量反相鍵合硅膠一起混合研磨，使樣品均勻分散于固定相顆粒的表面，制成半固態(tài)裝柱，然后后采用類似于SPE的操作進(jìn)行洗脫。所用的填充料一般為C18或C8，樣品和填充料的比例通常為1:4。,,MSPD是一種在SPE的基礎(chǔ)上改進(jìn)后的樣品處理方法，相對(duì)于SPE法，它的優(yōu)點(diǎn)在于：依靠機(jī)械剪切力、C18鍵合相的去垢效應(yīng)和巨大的表面積，使樣品結(jié)構(gòu)破碎并且在填料表面均勻分散，濃縮了傳統(tǒng)的樣品前處理中所需的

56、樣品勻化、組織細(xì)胞裂解、提取、凈化等過(guò)程，避免了樣品勻化、轉(zhuǎn)溶、乳化、濃縮造成的待測(cè)物損失，而且固定相處理樣品的比容量大，提取凈化的效率較高。MSPD處理樣品耗時(shí)短、節(jié)省溶劑、樣品用量少，該方法已被用于近40種的獸藥殘留分析。,4、柱切換技術(shù),柱切換技術(shù)是色譜分析中處理復(fù)雜樣品的方法之一。利用切換閥改變不同的色譜系統(tǒng)，達(dá)到在線樣品凈化、組分富集等目的。此法常用一種長(zhǎng)3~5cm，填以粒徑25~40µm填料（類型取決于待測(cè)物的

57、保留能力）的預(yù)柱，通過(guò)切換閥與分析柱連接。進(jìn)樣后流動(dòng)相Ⅰ攜帶樣品進(jìn)入色譜柱，被測(cè)組分保留于預(yù)柱上，而雜質(zhì)則隨流動(dòng)相Ⅰ作為廢液 流出。然后按預(yù)先設(shè)定的程序改變切換閥的流路，將流動(dòng)相Ⅱ引入預(yù)柱中，流動(dòng)相Ⅱ洗脫出的被測(cè)組分隨即進(jìn)入分析柱，經(jīng)分離后進(jìn)入檢測(cè)器檢測(cè)。,柱切換法的優(yōu)點(diǎn),①操作簡(jiǎn)單，全自動(dòng)化，含蛋白樣品可直接進(jìn)樣或簡(jiǎn)單地沉淀蛋白離心后即可進(jìn)樣；②分析結(jié)果精密度高，一般無(wú)需內(nèi)標(biāo)，進(jìn)樣體積一般為0.2~1.0mL（血漿、血清因黏度較大

58、，需稀釋后進(jìn)樣），在線處理全過(guò)程由計(jì)算機(jī)程序控制，每個(gè)樣品在同一預(yù)柱的相同條件下處理，分析結(jié)果的RSD一般小于5%。③適于不穩(wěn)定樣品，如易光解、熱不穩(wěn)定樣品的分析，全部過(guò)程在封閉狀態(tài)下進(jìn)行，避免了分離、濃縮等操作；④富集作用，提高了檢測(cè)靈敏度，尤其是極性較大的組分，無(wú)法用液-液萃取時(shí)，柱切換技術(shù)特別奏效。,5、超臨界流體萃取（SFE）,超臨界流體萃取是一種較新的樣品預(yù)處理技術(shù)，以超臨界流體（常用二氧化碳）作為提取溶劑。超臨界流體的

59、性質(zhì)如密度、粘度和擴(kuò)散性等處于氣體和液體之間，而且與溫度、壓力和流體組成有關(guān)。密度越高,其性質(zhì)越接近液體;密度越低,其性質(zhì)越接近氣體。超臨界流體既能溶解各種氣體不溶解的物質(zhì),又有氣體黏度小、滲透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),可以快速、高效地將被測(cè)物從樣品中萃取出來(lái)。,超臨界二氧化碳萃取流程圖,二氧化碳液體由高壓泵輸入處于恒溫的預(yù)熱管中轉(zhuǎn)化為超臨界流體并進(jìn)入樣品管進(jìn)行萃取。萃取物隨流體通過(guò)限流管降溫后進(jìn)入有少量填料的吸收管內(nèi),最后被收集瓶收集。超臨界

60、流體萃取過(guò)程大致可分為下面三步:①待測(cè)物質(zhì)從樣品基質(zhì)中釋放出來(lái)并擴(kuò)散、溶解進(jìn)入超臨界流體中；②待測(cè)物質(zhì)從萃取器轉(zhuǎn)移至收集系統(tǒng)；③降低超臨界流體的壓力，有效地收集被萃取的待測(cè)物。,,對(duì)于極性較大或者離子型化合物,可選擇氨等萃取劑。壓力的變化可以改變超臨界流體對(duì)物質(zhì)的溶解度,因此采用程序升壓就可以把溶解度從大到小的物質(zhì)先后從樣品中分離出來(lái)。根據(jù)被萃取物溶解度的大小,可以采用動(dòng)態(tài)、循環(huán)和靜態(tài)不同的操作方法。動(dòng)態(tài)法是讓流體一次通過(guò)樣

61、品,這種方法適合溶解度較大的樣品。靜態(tài)法是將樣品在流體中浸泡一段時(shí)間后,再使被萃取物從樣品中分離出來(lái)。循環(huán)法是讓一定量的流體循環(huán)多次通過(guò)樣品,循環(huán)法既可以萃取難溶物質(zhì)同時(shí)又比靜態(tài)法萃取速度快。,6、固相微萃?。⊿PME）,固相微萃取的原理與SPE不同，是建立在待測(cè)物在固定相和水相之間達(dá)成平衡分配的基礎(chǔ)上。其樣品的前處理和操作也有很大的差異。固相微萃取采用熔融石英光導(dǎo)纖維為固相吸附劑,將其浸泡在樣品溶液中時(shí),樣品中的有機(jī)物被吸附在光

62、導(dǎo)纖維的表面。吸附平衡后通過(guò)加熱可使被吸附的物質(zhì)解吸,被解吸的物質(zhì)可隨著載氣流入氣相色譜儀進(jìn)行分離測(cè)定。,,光導(dǎo)纖維是裝在類似于微量注射器的固相微萃取的針頭內(nèi),針頭起著導(dǎo)向和保護(hù)光導(dǎo)纖維不被折斷的作用。萃取時(shí)將針頭浸入被萃取液中,吸附平衡后再插入氣相色譜的進(jìn)樣口。光導(dǎo)纖維的吸附量和原始液的濃度有一定的關(guān)系。因此固相微萃取是一種簡(jiǎn)便、快速、無(wú)溶劑的前處理技術(shù)。,,固相微萃取法被廣泛地應(yīng)用于樣品的分析中。包括固態(tài)(如沉積物、土壤等)、液態(tài)

63、(地下水、地表水、飲用水、廢水)及氣態(tài)(空氣及廢氣)中的鹵代烴(包括鹵代芳烴)、有機(jī)氨農(nóng)藥、多環(huán)芳烴、胺類化合物以及石油類等。已有大量的應(yīng)用文獻(xiàn)報(bào)道。,7、免疫親和色譜IAC,免疫親和色譜(Immµno-afinity chromatograplly, IAC)是以抗原抗體的特異性、可逆性免疫結(jié)合反應(yīng)為原理的色譜技術(shù),其基本過(guò)程為將抗體與惰性基質(zhì)(如珠狀瓊脂糖、鍵合相硅膠)偶聯(lián)制成固定相,裝柱。當(dāng)含有待測(cè)組分的樣品通過(guò)IA

64、C柱時(shí),固定抗體選擇性地結(jié)合待測(cè)物,其他不被識(shí)別的樣本雜質(zhì)則不受阻礙地流出IAC柱,經(jīng)洗滌除去雜質(zhì)后將抗原-抗體復(fù)合物解離,待測(cè)物被洗脫,樣品得到凈化。IAC的最顯著優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)待測(cè)物的高效、高選擇性保留能力,特別適用于復(fù)雜樣品痕量組分的凈化與富集。,,,第六章 獸藥殘留檢測(cè)技術(shù),第三節(jié) 樣品衍生化技術(shù),一、衍生化,衍生化是將樣品中的待測(cè)組分制成衍生物,使其更適合于特定的分析方法。衍生化在色譜分析中的作用歸納起來(lái)主要有以下幾點(diǎn):

65、①提高檢測(cè)靈敏度;②改變化合物的色譜性能,改善分離效果;③適合進(jìn)一步做化合物的結(jié)構(gòu)鑒定;④擴(kuò)大色譜分析的應(yīng)用范圍。,(1)柱前衍生化,柱前衍生化是在色譜分離前,預(yù)先將樣品制成適當(dāng)?shù)难苌?然后進(jìn)行分離和檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)：衍生化試劑、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)條件的選擇都不受色譜條件的限制,衍生化后的樣品能用各種預(yù)處理方法進(jìn)行純化和濃縮,也不需要附加特殊的儀器設(shè)備。缺點(diǎn)：操作比較繁雜費(fèi)時(shí),容易引起誤差,影響測(cè)定的準(zhǔn)確度。當(dāng)衍生化試劑的分子量相對(duì)

66、大時(shí),其引入還可能減小組分間由于分子大小差別而產(chǎn)生的色譜保留行為的差別。,(2)柱后衍生化,柱后衍生化是樣品經(jīng)色譜分離后,使衍生化試劑與色譜流出組分在系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行反應(yīng),然后檢測(cè)衍生物。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好,色譜分離相衍生化連續(xù)自動(dòng)進(jìn)行,而且衍生化不影響組分的色譜分離。缺點(diǎn)：需要附加輸液泵、混合室和反應(yīng)器等裝置,由于柱出口至檢測(cè)器間有較長(zhǎng)的流程,可能發(fā)生色譜峰展寬。,實(shí)現(xiàn)柱后衍生化必須滿足下列條件:,①衍生化試劑足夠穩(wěn)定,對(duì)檢測(cè)器的

67、響應(yīng)可以忽略,不產(chǎn)生干擾;②衍生化試劑溶液與色譜流動(dòng)相能互相混溶,混合后不產(chǎn)生沉淀或分層,而且色譜流動(dòng)相適宜作衍生化反應(yīng)的介質(zhì);③衍生化試劑與色譜柱流出液的速度要匹配,混合迅速且均勻,以免產(chǎn)生噪聲;④衍生化反應(yīng)必須迅速和重現(xiàn)性好,反應(yīng)器設(shè)計(jì)要合理,以盡可能減少峰展寬。,二、HPLC柱后衍生化,(1)柱后衍生化裝置柱后衍生化使色譜柱至檢測(cè)器之間增加了混合器與反應(yīng)器及多個(gè)連接部件,這些都將產(chǎn)生柱外效應(yīng),導(dǎo)致峰展寬。連接部件產(chǎn)生的峰

68、展寬決定于所用的材料、長(zhǎng)度和內(nèi)徑,需要仔細(xì)選擇。高效率混合器管式反應(yīng)器：螺旋型、編織型,,(2)固相衍生化,將固體微粒(硅膠或高分子微球)填充于內(nèi)徑5~6mm、長(zhǎng)度25~30cm的柱子內(nèi)就是一個(gè)固相衍生化器。固體微粒的表面通常經(jīng)過(guò)處理連接有反應(yīng)基團(tuán),叫作固相反應(yīng)劑。固相反應(yīng)劑的種類很多,包括氧化型、還原型、基團(tuán)轉(zhuǎn)移型和催化劑型,可適應(yīng)各種衍生化反應(yīng)的需要。樣品通過(guò)時(shí)與反應(yīng)劑發(fā)生衍生化反應(yīng),這是一種非均勻體系的反應(yīng)。大分子只能