第六章 外源目的基因表達(dá)與調(diào)控

1、第六章 外源目的基因表達(dá)與調(diào)控,生物體的遺傳信息都是以核苷酸序列編碼的形式儲(chǔ)存在遺傳物質(zhì)DNA上, 基因表達(dá)是目的基因DNA在導(dǎo)入的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA, 再以mRNA指導(dǎo)翻譯成蛋白質(zhì)?；虻谋磉_(dá)依賴于有效的轉(zhuǎn)錄和mRNA的正確翻譯以及翻譯后的加工處理等各個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)作用，其中轉(zhuǎn)錄最為關(guān)鍵，原核的基因表達(dá)過(guò)程和方式與真核細(xì)胞有顯著不同。,外源基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)重要環(huán)節(jié)。 基因的轉(zhuǎn)錄是在RNA聚合酶

2、的作用下合成mRNA，原核生物mRNA一般不需要轉(zhuǎn)錄后加工。 真核生物mRNA在細(xì)胞內(nèi)合成，且需要經(jīng)過(guò)一繁殖加工過(guò)程：RNA剪接、5′端加帽、 3′端加上poly(A)尾巴。 原核生物一般沒有翻譯后加工，真核生物有較復(fù)雜的翻譯后加工。,第一節(jié) 外源基因表達(dá)機(jī)制,一、外源基因的起始轉(zhuǎn)錄 外源基因的起始轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。選擇可調(diào)控的啟動(dòng)子和相關(guān)的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)首先要考慮

3、的問題。 理想的可調(diào)控的啟動(dòng)子在細(xì)胞生長(zhǎng)的初期不表達(dá)或低水平表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定的密度后，在某種特定誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)下，RNA聚合酶開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，合成mRNA。,二、mRNA的延伸與穩(wěn)定性 外源基因起始轉(zhuǎn)錄后，保持mRNA的有效延伸、終止及穩(wěn)定存在是外源基因有效表達(dá)的關(guān)鍵。 為了防止mRNA在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的非特異性終止，可以在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)加入抗終止的序列元件。 在表達(dá)載體中加入正常

4、轉(zhuǎn)錄終止序列，可以防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使mRNA的長(zhǎng)度限制在一定的范圍內(nèi)，增加外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性。,三、外源基因mRNA的有效翻譯 外源基因在原核生物中的有效翻譯需要考慮： 1. AUG(ATG)是首選的密碼子； 2. SD序列為與核糖體16S rRNA互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，該序列至少含有AGGAGG序列中的4個(gè)堿基； 3. SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離為3~9個(gè)堿基

5、； 4. 在翻譯起始區(qū)的周圍的序列不易形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。,真核細(xì)胞mRNA的5′非翻譯區(qū)不存在SD序列，但絕大多數(shù)mRNA的起始序列含有共同序列。 不同生物使用密碼子具有不同的偏好性。如果外源基因的mRNA密碼子使用受體的偏好密碼子，則表達(dá)效率高。 mRNA上的終止密碼對(duì)正確翻譯的效率有很大影響。在原核細(xì)胞中，UAA為最常用的終止密碼子。,四、表達(dá)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的穩(wěn)定性

6、外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定積累，不被宿主蛋白酶所降解，可有效提高表達(dá)量。 避免外源蛋白被宿主蛋白酶降解的措施: 1.構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)。 2.構(gòu)建分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)。 3.構(gòu)建包涵體表達(dá)系統(tǒng)。 4.選擇蛋白酶缺陷型的受體系統(tǒng)。,五、基因沉默 基因沉默是導(dǎo)致外源基因不能正常表達(dá)的重要因素，主要出現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因植物中

7、。 目的基因沉默是在核酸水平上DNA與DNA、DNA與RNA、RNA與RNA相互作用的結(jié)果。重復(fù)序列或同源序列是基因沉默的普遍原因之一，在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)盡可能避免與內(nèi)源序列有較高的同源性。,第二節(jié) 基因表達(dá)的調(diào)控元件,一、啟動(dòng)子 啟動(dòng)子是一段提供RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，一般位于表達(dá)基因的上游。 1.序列特異性。在啟動(dòng)子的DNA序列中，通常含有幾個(gè)保守的序列框。

8、 2.方向性。啟動(dòng)子是一種有方向性的順式調(diào)控元件。 3.位置特性。一般啟動(dòng)子只能啟動(dòng)其下游基因的轉(zhuǎn)錄。 4.種屬特異性。,二、增強(qiáng)子 增強(qiáng)子是能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的DNA順式作用序列。 1.雙向性。正反兩個(gè)方向調(diào)節(jié)活性。 2.重復(fù)序列。增強(qiáng)子一般含有能獨(dú)立行使功能的重復(fù)序列。 3.功能與位置無(wú)關(guān)。 4.特異性。組織特異

9、性，或在特定細(xì)胞階段。 5.對(duì)異源基因也有調(diào)節(jié)功能。,三、終止子 終止子是提供終止信號(hào)使RNA聚合酶停止轉(zhuǎn)錄的DNA序列。 本征終止子指不需要其他蛋白輔助因子便可在特殊的RNA結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)實(shí)現(xiàn)終止作用。屬于強(qiáng)終止子。 依賴型終止子需要ρ因子的輔助，屬于弱終止子。,四、衰減子 衰減子是基因表達(dá)調(diào)控的精細(xì)調(diào)節(jié)裝置，利用原核生物轉(zhuǎn)錄與翻譯相偶聯(lián)的特性，依賴自身巧妙

10、的特征序列和相應(yīng)的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行地開關(guān)式的微調(diào)作用，從而保證原核生物在相關(guān)操縱子處于阻遏的狀態(tài)下仍能以一個(gè)本底水平合成氨基酸、核苷酸和抗生素等。,五、絕緣子 絕緣子長(zhǎng)約幾百個(gè)核苷酸，是通常位于啟動(dòng)子同正調(diào)控元件(增強(qiáng)子)或負(fù)調(diào)控因子之間的一種調(diào)控序列。絕緣子本身對(duì)基因的表達(dá)既沒有正效應(yīng)，也沒有負(fù)效應(yīng)，其作用只是不讓其他調(diào)控元件對(duì)基因的活化效應(yīng)或失活效應(yīng)發(fā)生作用。,六、反義子 反

11、義RNA是一類與特定DNA序列互補(bǔ)的小分子RNA。編碼反義RNA的DNA稱為反義子。反義RNA廣泛存在于原核生物和真核生物中，在DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯三個(gè)水平對(duì)基因的表達(dá)起著調(diào)節(jié)作用，其中以對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制最普遍。,第三節(jié) 外源基因表達(dá)與調(diào)控,外源基因表達(dá)包括目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，并能在其中有效表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物(目的蛋白)。 外源基因表達(dá)系統(tǒng)由基因表達(dá)載體和相應(yīng)的受體細(xì)胞兩部分組成。

12、,外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理 啟動(dòng)子 終止子 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 密碼子 質(zhì)粒拷貝數(shù),,轉(zhuǎn)錄,,翻譯,一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,R,－35,－10,SD,編碼序列,Ori,Tcr,TT,啟動(dòng)子,起始密碼子AUG、GUG、UUG,,終止密碼子UAAU、UGA、UAG,,,大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體一般是質(zhì)粒表達(dá)載

13、體，含有大腸桿菌內(nèi)源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)和有關(guān)序列組成的能在大腸桿菌中有效復(fù)制的復(fù)制子。,(一)大腸桿菌基因表達(dá)載體,,核糖體結(jié)合位點(diǎn),,啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄終止子,復(fù)制起點(diǎn),1. 復(fù)制子是一段包含復(fù)制子起始位點(diǎn)和反式因子靶序列在內(nèi)的DNA片段。 大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體一般是質(zhì)粒表達(dá)載體，含有大腸桿菌內(nèi)源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)和有關(guān)序列組成的能在大腸桿菌中有效復(fù)制的復(fù)制子。,2.啟動(dòng)子和終止子 啟動(dòng)子是調(diào)

14、控外源基因轉(zhuǎn)錄的重要順式元件。理想的啟動(dòng)子應(yīng)該具備以下性質(zhì)： 第一, 必須是強(qiáng)啟動(dòng)子，能夠克隆基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上 第二, 這個(gè)啟動(dòng)子應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平，因?yàn)樵诒磉_(dá)毒性蛋白質(zhì)或是有損于寄主細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)的情況下，使用高度抑制型的啟動(dòng)子是一種極為重要的條件 第三, 這種啟動(dòng)子應(yīng)是誘導(dǎo)型的，能通過(guò)簡(jiǎn)單的方式使用廉價(jià)的誘導(dǎo)物而得以

15、誘導(dǎo)。,外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過(guò)頭現(xiàn)象，即 RNA 聚合酶滑過(guò)終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的 DNA 序列，形成長(zhǎng)短不一的 mRNA 混合物過(guò)長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會(huì)影響外源基因的表達(dá)，其原因如下： 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長(zhǎng)，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子 mRNA 所需的時(shí)間就相應(yīng)增加，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降； 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或 DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo)記基因

16、和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則 RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性； 過(guò)長(zhǎng)的 mRNA 往往會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無(wú)謂的能量消耗； 更為嚴(yán)重的是，過(guò)長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級(jí)結(jié)構(gòu)， 從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率。,終止子,強(qiáng)終止子的選擇與使用 目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來(lái)自大腸桿菌 rRNA 操縱子上

17、 的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌體 DNA 上的 Tf。 對(duì)于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特 殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用,,,3.核糖體結(jié)合位點(diǎn) 外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻 率，而且在很大程度上還與 mRNA 的翻譯起始效率密切相關(guān)。 大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的 mRNA分子具有不同

18、的翻譯效率，它們之間的差別有時(shí)可高達(dá)數(shù)百倍。 mRNA 翻譯的起始效率主要由其 5’ 端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）。,大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素： 位于翻譯起始密碼子上游的 6–8 個(gè)核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’ 即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過(guò)識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞 基中的 16S

19、rRNA 3’ 端區(qū)域 3’ AUUCCUCC 5’ 并與之專一性結(jié)合 將mRNA 定位于核糖體上，從而啟動(dòng)翻譯； 翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以 AUG作為閱讀框架的 起始位點(diǎn)，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作為翻譯起始密碼子 SD 序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 基因編碼區(qū) 5’ 端若干密碼子的

20、堿基序列,,,,,4.密碼子 不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)簡(jiǎn)并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性。外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)需考慮密碼子的偏好性。5.選擇標(biāo)記 大腸桿菌的選擇標(biāo)記一般采用抗生素抗性基因。,(二)宿主菌 外源基因表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)容易被降解，為了避免降解，需要構(gòu)建與表達(dá)載體相適應(yīng)的大腸桿菌宿主菌。如BL21。,（三）常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

21、 目前應(yīng)用廣泛的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)主要有Lac和Tac表達(dá)系統(tǒng)，PL和PR表達(dá)系統(tǒng)，T7表達(dá)系統(tǒng)。 Lac和Tac表達(dá)系統(tǒng)是以lac操縱子調(diào)控機(jī)制為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)。,P tac = 3 P trp = 11 P lac,啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理 具有多順反子結(jié)構(gòu)，基因排列次序?yàn)椋?啟動(dòng)子（lacP）- 操縱基因（lacO） - 結(jié)構(gòu)基因（lacZ-lacY-lac

22、A） 正調(diào)節(jié)因子 CAP 負(fù)調(diào)節(jié)因子 lac I,Lac 表達(dá)系統(tǒng) 以大腸桿菌 lac 操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng),,,,,,,lacI Plac lacO lacZ lacY lacA,,,,,,,lacI Plac

23、 lacO lacZ lacY lacA,Lac 表達(dá)系統(tǒng) 正調(diào)節(jié)因子 CAP cAMP激活CAP，CAP–cAMP復(fù)合物與 lac 操縱子上專一位點(diǎn)結(jié)合 后，能促進(jìn) RNA 聚合酶與 –35、–10 序列的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn) Plac 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。,基因工程中使用的 lac 啟動(dòng)子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即

24、Plac UV5,Lac 表達(dá)系統(tǒng) lac UV5 突變體 Plac UV5 突變體能夠在沒有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 轉(zhuǎn)錄，受它控制的基因在轉(zhuǎn)錄水平上只受 lacI 的調(diào)控，因此用它 構(gòu)建的表達(dá)載體在使用時(shí)比野生型 Plac 更易操作。,Lac 表達(dá)系統(tǒng) 負(fù)調(diào)節(jié)因子 lac I 在無(wú)誘導(dǎo)物情形下

25、， lacI 基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白，與啟動(dòng) 子下游的操縱基因緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始。,,,,,,,lacI Plac lacO lacZ lacY lacA,,,,,,,,lacI Plac lacO lacZ lacY lacA,

26、,Tac 表達(dá)系統(tǒng) tac 啟動(dòng)子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的雜 合啟動(dòng)子。 調(diào)控模式與 lacUV5 相似，但 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平高于 trp 和 lacUV5 啟動(dòng)子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有較高基因表達(dá) 水平的情況下，選用

27、 tac 啟動(dòng)子比用 lacUV5 啟動(dòng)子更優(yōu)越。,,,lac、tac 啟動(dòng)子對(duì)宿主菌的要求 在普通大腸桿菌中， LacI 阻遏蛋白僅能滿足細(xì)胞染色體上 lac 操縱子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的需要。 當(dāng)多拷貝的 lacO 隨著帶有 lacUV5、tac 啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入 大腸桿菌后，LacI 阻遏蛋白與 lacO 的比例顯著下降，無(wú)法保證每一

28、個(gè) lacO 都能獲得足夠的 LacI 阻遏蛋白參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。表現(xiàn)為在無(wú)誘 導(dǎo)物存在的情形下， lacUV5、tac 啟動(dòng)子有較高的本底轉(zhuǎn)錄。,,,lac、tac 啟動(dòng)子對(duì)宿主菌的要求 為了使以 Lac、Tac 表達(dá)系統(tǒng)具有嚴(yán)緊調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄的能力，一 種能產(chǎn)生過(guò)量的 LacI 阻遏蛋白的 lacI 基因的突變體 lacIq 被應(yīng)用于表 達(dá)系統(tǒng)。 大腸桿

29、菌 JM109 等菌株的基因型均為 lacIq ，常被選用為 Lac、Tac 表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌。 但是這些菌株也只能對(duì)低拷貝的表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)嚴(yán)緊調(diào)控，在使用高拷 貝復(fù)制子構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，仍能觀察到較高水平的本底轉(zhuǎn)錄。 需在表達(dá)載體中插入 lacIq 基因以保證有較多的 LacI 阻遏蛋白產(chǎn)生。,,,,lac、tac 表達(dá)系統(tǒng)存在的問題 I

30、PTG 用于誘導(dǎo) lac、tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，但由于 IPTG 本身具有一定的 毒性。從安全角度，對(duì)表達(dá)和制備用于醫(yī)療目的的重組蛋白并不適合。 一些國(guó)家規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝中不能使用 IPTG 解決方法 lac 和 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)緊調(diào)控 乳糖替代 IPTG 誘導(dǎo) lac 和 t

31、ac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄,,,lac、tac 表達(dá)系統(tǒng)存在的問題 lac 和 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)緊調(diào)控 把阻遏蛋白 LacI 的溫度敏感突變體lacI(ts)、lacIq(ts)插入表達(dá)載體或 整合到染色體后，均能使 lac 和 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受到溫度嚴(yán)緊調(diào)控 在較低溫度（30℃）時(shí)抑制，在較高溫度（42℃）時(shí)開放。 用乳糖替代

32、 IPTG 誘導(dǎo) lac 和 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄 乳糖在 b-半乳糖苷酶作用下生成異乳糖，異乳糖具有誘導(dǎo)劑的作用 這一過(guò)程涉及乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化，其效率受到多種因素的影響和制約 因此乳糖誘導(dǎo)的有效劑量大大高于IPTG。 乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用，較多的乳糖存在也 會(huì)導(dǎo)致菌體生理及生長(zhǎng)特性變化。乳糖替代

33、 lPTG 作為誘導(dǎo)劑的研究 要與發(fā)酵工藝結(jié)合起來(lái)，才能顯示其良好的前景。,,T7 表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌 T7 噬菌體具有一套專一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一 體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為 T7 表達(dá)系統(tǒng)。,T7 表達(dá)系統(tǒng) T7 噬菌體基因 1 編碼的 T7 RNA 聚合酶選擇性的激活 T7 噬菌體啟 動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。

34、 T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大腸桿菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌 RNA聚合酶有效轉(zhuǎn) 錄的序列。 在細(xì)胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬菌體啟動(dòng)子的情形下，大腸桿 菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競(jìng)爭(zhēng)不過(guò) T7 噬菌體轉(zhuǎn)錄體系，最

35、終受 T7噬 菌體啟動(dòng)子控制的基因的轉(zhuǎn)錄達(dá)到很高的水平。,,,,T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 T7 噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄完全依賴于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA 聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式就決定了表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控方式。 化學(xué)誘導(dǎo)型 溫度誘導(dǎo)型

36、 雙質(zhì)粒系統(tǒng),T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 化學(xué)誘導(dǎo)型 噬菌體 DE3 是 l 噬菌體的衍生 株，一段含有 lacI、lacUV5 啟 動(dòng)子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中 用噬菌體 DE3 的溶源菌作為表 達(dá)載體的宿主菌，

37、調(diào)控方式為 化學(xué)誘導(dǎo)型，類似于 Lac 表達(dá) 系統(tǒng)。,,,T7 RNA 聚合酶基因,lac 啟動(dòng)子,,,,E.Coli （DE3）,,,IPTG誘導(dǎo),T7 表達(dá)系統(tǒng)存在的問題 T7 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的基因的水平是目前所有表達(dá)系統(tǒng)中最高的，但 也不可避免出現(xiàn)相對(duì)較高的本底轉(zhuǎn)錄，如果目的基因產(chǎn)物對(duì)大腸桿 菌宿主有毒性，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。 解決

38、辦法之一 在表達(dá)系統(tǒng)中低水平表達(dá) T7 溶菌酶基因。 因?yàn)?T7 溶菌酶除了作用于大腸桿菌細(xì)胞壁上肽聚糖外，還能與 T7 RNA 聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄的活性。 目前 T7 溶菌酶基因都通過(guò)共轉(zhuǎn)化質(zhì)拉導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)，它能明顯 降低本底轉(zhuǎn)錄，但對(duì)誘導(dǎo)后目的基因的表達(dá)水平無(wú)明顯影響。,,,1.包涵體蛋白

39、 在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（Inclusion Bodies，IB）。 富含蛋白質(zhì)的包涵體多見于生長(zhǎng)在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細(xì)胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會(huì)喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。 由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，

40、后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。 除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。,（四）外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式,以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn) 在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標(biāo)蛋白的富集 簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作

41、 包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌 體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過(guò)高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì) 菌裂解物中分離出來(lái) 能夠表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標(biāo)蛋白。,以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn) 以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過(guò) 有效的變性復(fù)

42、性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具 有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對(duì)目標(biāo) 產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。 經(jīng)過(guò)復(fù)性處理的目標(biāo)蛋白不一定能完全恢復(fù)原來(lái)的生物學(xué)活性， 有時(shí)甚至完全得不到有活性的蛋白質(zhì)，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的 Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)停?一

43、般不 超過(guò) 30% 復(fù)性處理工藝可使目標(biāo)蛋白的制備成本上升。,2.融合蛋白 將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個(gè)基因的開放閱讀框，以這種方式表達(dá)的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。 外源蛋白與菌體自身蛋白融合表達(dá)后穩(wěn)定性大大增加，避免受到菌體蛋白酶的降解。,,與純化包涵體相比，細(xì)胞質(zhì)中以可溶性形式表達(dá)蛋白質(zhì)的分離純化過(guò)程比較

44、復(fù)雜，一般要通過(guò)親合層析才能達(dá)到比較高的純度。 目標(biāo)蛋白與有親合配基的序列融合表達(dá)既可以提高分離純化的效率，又能在融合蛋白切離的過(guò)程中得到?jīng)]有附加甲硫氨酸目標(biāo)蛋白。 金黃色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z，日本血吸蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白，His-tag 等是目前常用的與目標(biāo)基因融合表達(dá)的序列。,3.寡聚型外源蛋白 在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，將多個(gè)外源基因串聯(lián)在一起，克隆在低拷貝質(zhì)粒上。

45、 有三種方式： 多表達(dá)單元的重組，含有獨(dú)立的啟動(dòng)子、SD序列、起始密碼子和終止密碼子。 多順反子重組，有各自的SD序列、翻譯起始和終止信號(hào)，共用啟動(dòng)子和終止子。 多編碼序列重組，多個(gè)外源基因串聯(lián)在一起，利用同一套轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和翻譯起始與終止密碼子，在各編碼序列的接口處引入蛋白酶切割位點(diǎn)。,4.整合型外源蛋白的表達(dá) 將要表達(dá)的外源基因整合到染色

46、體的特定位置上，使之成為染色體結(jié)構(gòu)的一部分而穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)。5.分泌型蛋白的表達(dá) 將外源蛋白通過(guò)運(yùn)輸或分泌的方式穿過(guò)細(xì)胞的外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中表達(dá)。 大腸桿菌分泌能力較低，可將外源蛋白運(yùn)輸?shù)街苜|(zhì)空間，只有少數(shù)蛋白可穿過(guò)外膜。,目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)的優(yōu)點(diǎn) ⑴ 大腸桿菌周質(zhì)空間中自身蛋白質(zhì)的數(shù)量約為 100 種，只占菌體總蛋白數(shù)量的4%。蛋白水解酶的含最與細(xì)胞質(zhì)中的

47、相比也少得多，因此目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)有利于分離純化和減少蛋白水解酶的降解。 ⑵ 目標(biāo)蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間過(guò)程中信號(hào)肽被加工切除，有效地避免了N 端附加的甲硫氨酸的產(chǎn)生。 ⑶ 周質(zhì)空間中呈氧化型的氧化還原態(tài)勢(shì)使目標(biāo)蛋白能夠較好折疊，維持正確的構(gòu)象。,目標(biāo)蛋白外泌表達(dá) 把所表達(dá)的目標(biāo)蛋白外泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中可以進(jìn)一步減少蛋白水解酶的降解，也有利于分離純化。 目前成功的例子主要是采用以下方

48、案: （1）與大腸桿菌本身的外泌蛋白基因融合表達(dá) （2）與一些能提高細(xì)胞外膜通透性的因子融合或共表達(dá) （3）改變培養(yǎng)基的成分 已有的研究結(jié)果顯示這些方法僅對(duì)外泌分子量較小的蛋白有效，而且外泌效率一般都比較低。,1.優(yōu)化表達(dá)載體的設(shè)計(jì) 啟動(dòng)子、終止子、SD序列2. 提高稀有密碼子tRNA的表達(dá)作用3. 提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性4. 提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 分泌表達(dá)，選用