sirna干預(yù)樹突狀細胞cd40分子表達實驗研究

1、,siRNA干預(yù)樹突狀細胞CD40分子表達的實驗研究,,A Study of siRNA on inhibiting the Expression of Dendritic Cell CD40,吉林工程技術(shù)師范學院 - 消化內(nèi)科,楊2012.04,,,IBD的發(fā)病機制實驗內(nèi)容實驗結(jié)果討論結(jié)論,吉林工程技術(shù)師范學院,,,炎癥性腸?。↖nflamma

2、tory bowl disease IBD）,IBD是臨床常見的腸道炎性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative co1itis, UC）和克羅恩?。–rohn,s disease，CD）兩大類。IBD的發(fā)病機制可以概括為：1、環(huán)境因素；2、遺傳因素；3、感染因素；4、免疫耐受。IBD的治療：1、常規(guī)治療；2、免疫調(diào)節(jié)治療；3、生物調(diào)控等。,吉林工程技術(shù)師范學院IBD的發(fā)病機制,,,IBD的發(fā)病機制-環(huán)境因素,隨著社會的發(fā)展，全

3、球IBD的發(fā)病率呈明顯的上升趨勢，首先出現(xiàn)在社會經(jīng)濟高度發(fā)達的北美、北歐，繼而發(fā)生在西歐、南歐，最近才是日本、南美。這種變化產(chǎn)生的主要原因大都是環(huán)境因素的改變所導致，大量研究表明，許多看似無關(guān)的環(huán)境因素，諸如吸煙、飲食、藥物、地理環(huán)境、社會地位、應(yīng)激、腸道固有菌群、腸粘膜的滲透性和闌尾切除等這些因素在不同程度上與IBD息息相關(guān)。目前公認的假說認為：環(huán)境變得越來越清潔，導致兒童期腸道免疫系統(tǒng)接受的外源刺激減弱，由于早年形成的“免疫耐受”

4、不完善，其對腸道抗原刺激發(fā)生的免疫反應(yīng)的自身調(diào)節(jié)就容易發(fā)生障礙，故出現(xiàn)IBD發(fā)病率逐漸上升。,吉林工程技術(shù)師范學院 環(huán)境因素,,,IBD的發(fā)病機制-遺傳因素,家族聚集性和種族差異性：IBD患者一級親屬發(fā)病率，明顯高于普通人群。 基因：全基因組相關(guān)研究(GWAS)已展開，且成為IB

5、D研究的主要手段。 陽性家族史：IBD遺傳因素中遺傳易感性最為重要，其中陽性家族史是最大的“危險因子”IBD不僅是多基因病，而且也是遺傳異質(zhì)性疾病，患者在一定的環(huán)境因素作用下因遺傳易感而最終發(fā)病。,吉林工程技術(shù)師范學院遺傳因素,,,IBD的發(fā)病機制-感染因素,微生物致病性的觀點認為IBD(特別是CD)針對自身正常腸道菌群叢的異常免疫反應(yīng)引起的。其證據(jù)為：①CD病變的部位在腸菌濃度最高的末回與結(jié)腸。②CD患者糞便轉(zhuǎn)流術(shù)使炎癥減輕，復原

6、后炎癥加重。③各種動物實驗要有細菌定植才發(fā)生結(jié)腸炎癥，隔離的腸攀導入細菌可出現(xiàn)早期IBD的表現(xiàn)。④臨床上應(yīng)用抗生素和微生態(tài)制劑有一定的臨床療效。感染與IBD的關(guān)系：①腸道感染可以與IBD類似。②感染比IBD更常見。③感染使IBD的病程變得更加復雜。,吉林工程技術(shù)師范學院 感染因素,

7、,,IBD的發(fā)病機制-免疫耐受,免疫調(diào)節(jié)細胞 。人類β防御素?？乖蔬f細胞 。人類白細胞抗原 。自身抗體因素 。Chemerin和脂聯(lián)素 。,吉林大學第二臨床醫(yī)院 免疫耐受,,,IBD的發(fā)病機制-免疫耐受,腸道粘膜免疫反應(yīng)的激活是導致IBD發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程的直接原因

8、。免疫調(diào)節(jié)T細胞，能夠產(chǎn)生各種細胞因子，引起并逐步放大粘膜炎癥，形成肉眼和鏡下的IBD病理及臨床表現(xiàn)。經(jīng)典的“雙信號模式”即免疫應(yīng)答的啟動、發(fā)展過程中，T細胞的活化需要兩個信號。其中第二信號即協(xié)同刺激信號，它能夠促進T細胞的克隆、細胞因子的分泌及產(chǎn)生效應(yīng)。CD40/CD40L即第二信號，它屬于TNF-TNF受體超家族，通過干預(yù)調(diào)節(jié)CD40/CD40L會有助于IBD的治療。,吉林工程技術(shù)師范學院

9、 免疫耐受,,,IBD的發(fā)病機制,Sands概括了近10年IBD發(fā)病機制研究的標志性成果：(1)腸道免疫耐受控制著生理性炎癥；(2)腸道菌群在IBD發(fā)病中起著關(guān)鍵作用；(3)用基因動物模型顯示遺傳免疫和黏膜屏障的多種紊亂形成IBD的各種亞型；(4)NOD2與CD的發(fā)生密切相關(guān)，且與天然免疫缺陷有關(guān)；(5)新生物技術(shù)快速發(fā)展

10、，研制出多種新的生物治療藥物；(6)TNFα單抗對CD與UC產(chǎn)生較好療效。,吉林工程技術(shù)師范學院IBD的發(fā)病機制,,,IBD的干預(yù)與治療,常規(guī)治療：1、支持治療；2、常規(guī)藥物治療；3、手術(shù)治療。免疫調(diào)節(jié)治療。生物調(diào)控：1、免疫調(diào)控-抗TNF-α抗體英夫利昔(Infliximab) 、胸腺肽；2、RNAi干預(yù)治療。阻斷CD40途徑用于IBD的治療及展望 。,吉林工程技術(shù)師范學院

11、 IBD的治療,,,實驗材料與方法,siRNA的設(shè)計與合成pHL-CD40真核表達載體的構(gòu)建 感受態(tài)細胞的制備 重組質(zhì)粒的提取免疫磁珠分離DCs 總RNA的提取、cDNA的逆轉(zhuǎn)錄,吉林工程技術(shù)師范學院 實驗

12、內(nèi)容,,,實驗材料與方法,磷酸鈣法瞬時轉(zhuǎn)染CD40分子 “Western blot、PCR”法檢測樹突狀細胞CD40蛋白質(zhì)及mRNA的表達統(tǒng)計學分析,吉林工程技術(shù)師范學院 實驗內(nèi)容,,,實驗研究的目的及意義,闡明CD40在IBD中的作用確定siRNA的高效性通過RNAi干預(yù)CD40分子的表達治療

13、IBD的動物實驗與臨床研究奠定了理論基礎(chǔ)。從而為IBD的治療提供新的途徑,吉林工程技術(shù)師范學院實驗內(nèi)容,,,實驗結(jié)果,吉林工程技術(shù)師范學院 實驗結(jié)果,1(sense）：5＇-GATCCGCTGTGAAGATCAGAAGCTTTCAAGAGA AGCTTCTGATCTTCACAGCTTA-3＇；

14、(antisense)： 5＇- AGCTTAAGCTGTGAAGATCAGAAGCT TCTCTTGAA AGCTTCTGATCT TCACAGCG-3＇;2(sense)： 5＇-GATCC GATCCTGTGGAGATAGAAG TTCAAGAGA CTTCTATCTCCACAGGATCTTA-3＇；(antisense)： 5＇-AGCTT AAGATCCTGTGGAGATAGAAG TCTCTTGAA CTC

15、TATCTCCACAGGATCG-3＇。,CD40基因的siRNA cDNA序列,1根據(jù)GenBank提供的大鼠CD40基因序列(NM─134360)，按照siRNA的設(shè)計原則，利用Ambion公司提供的網(wǎng)上在線設(shè)計工具(www．a(chǎn)mbion．com/techlib/misc/psilencer—con-verter．htm1)2根據(jù)RNA干涉載體pSilencer4.1-CMV neo的要求分別于上、下游引入BamH I和HidⅢ酶

16、切位點。構(gòu)建siRNA表達質(zhì)粒，合成正義、反義RNA片段各兩條，每段各設(shè)計一對55個堿基的序列 。經(jīng)北京華大基因測序成功,,,高效干涉載體雙酶切鑒定,吉林工程技術(shù)師范學院 實驗結(jié)果與分析,Marker ：DL20001.雙酶切鑒定重組表達高效載體pSilencer及干涉片段siCD40-1的構(gòu)建情況

17、2.空白組3.雙酶切鑒定重組表達高效載體pSilencer及干涉片段siCD40-2的構(gòu)建情況,圖1 高效干涉載體雙酶切鑒定,,,吉林工程技術(shù)師范學院 實驗結(jié)果與分析,pHL-CD40真核表達載體的構(gòu)建,根據(jù)大鼠CD40基因的編碼區(qū)序列設(shè)計引物，并在上、下游引物中分別引入BglⅡ和EcoRI限制性內(nèi)

18、切酶酶切位點。上、下游引物序列分別為： 5‘-CCGAATTCATGAACGGAAGAGTG-3’ 5‘-CGGATCCTCAAGTTGTCTTAGTC-3’以大鼠cDNA文庫為模板，通過進行PCR擴增。所得PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。,,,CD40基因的釣取,吉林工程技術(shù)師范學院 實驗

19、結(jié)果與分析,M：DL2000 Marker1.目的片段擴增的CD40的cDNA,圖2 PCR產(chǎn)物的電泳檢測,,,pHL真核表達載體的制備,吉林工程技術(shù)師范學院 實驗結(jié)果與分析,M：λHindⅢMarker1.酶切pHL片段 2.pHL載體,圖3 CD40 cDNA的pHL質(zhì)

20、粒的電泳檢測,將本實驗室保存的pHL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，并進行酶切鑒定,,,pHL-CD40重組表達載體的構(gòu)建,吉林工程技術(shù)師范學院 實驗結(jié)果與分析,圖4 pHL-CD40重組質(zhì)粒酶切鑒定,M：DL2000 Marker1.2.pHL-CD40重組質(zhì)粒用BglⅡ和Eco

21、RI雙酶切,將pHL載體及CD40的PCR產(chǎn)物cDNA片段分別用BglⅡ和EcoRI進行雙酶切，回收CD40片段及pHL酶切片段，進行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒進行重組質(zhì)粒的酶切鑒定。,,,Western blot檢測樹突狀細胞CD40分子蛋白表達的影響,1.制備細胞裂解液2.SDS-PAGE電泳分離及電轉(zhuǎn)移:siRNA轉(zhuǎn)染DC40配置48h后，經(jīng)12％SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉的雜交袋中，37.0℃，封閉1小

22、時，一抗(兔抗鼠CD40多克隆抗體1：1000)4℃孵育過夜，TBST洗膜10min×3次，二抗(HRP-羊抗鼠IgG 1：5000)室溫孵育1h，ECL發(fā)光試劑對PVDF膜進行顯色反應(yīng)，掃描并計算光密度值。進行發(fā)光檢測。每組樣本各重復實驗3次，計算平均值和標準差。,吉林工程技術(shù)師范學院

23、 實驗結(jié)果,,,Western blot檢測樹突狀細胞CD40分子蛋白表達的影響,吉林工程技術(shù)師范學院 實驗結(jié)果與分析,,圖5 免疫印跡法檢測轉(zhuǎn)染后的樹突狀細胞CD40分子的蛋白表達水平,A.在樹突狀細胞中轉(zhuǎn)染過表達重組質(zhì)粒pHL-CD40，并利用western blot檢測C

24、D40蛋白表達情況。GAPDH 為內(nèi)參。 B.在樹突狀細胞中轉(zhuǎn)染過表達重組質(zhì)粒pSilencer-CD40-1，并利用western blot檢測CD40蛋白表達情況。GAPDH 為內(nèi)參。C.在樹突狀細胞中轉(zhuǎn)染過表達重組質(zhì)粒pSilencer-CD40-2，并利用western blot檢測CD40蛋白表達情況。GAPDH 為內(nèi)參。,,,,PCR檢測樹突狀細胞CD40分子mRNA表達的影響,1.收集處對數(shù)長期細胞，提取各組細胞

25、總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。2.具備PCR反應(yīng)條件。3.PCR產(chǎn)物通過電泳鑒定，使用凝膠成像分析系統(tǒng)分析，來描述mRNA相對的表達量。每組樣本各重復實驗3次，計算平均值和標準差。,吉林工程技術(shù)師范學院 結(jié)果與分析實驗,,,PCR檢測樹突狀細胞CD40分子mRNA表達的影響,吉林工程技術(shù)師范學院

26、 實驗結(jié)果與分析,圖6 PCR檢測過表達重組質(zhì)粒pHL-CD40和干涉重組質(zhì)粒pSilencer-CD40-1的轉(zhuǎn)染對樹突狀細胞CD40分子mRNA表達的影響,1.樹突狀細胞轉(zhuǎn)染過表達重組質(zhì)粒pHL-CD40，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后PCR檢測CD40分子mRNA表達情況。2.沒進行轉(zhuǎn)染的空白對照組。3.樹突狀細胞轉(zhuǎn)染干涉重組質(zhì)粒pSilencer-CD40

27、-1，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后PCR檢測CD40分子mRNA表達情況。GAPDH為內(nèi)參。,,,討論,1.如何成功構(gòu)建了RNA干涉表達載體pSilencer-CD40及RNAi的技術(shù)特點。2.闡述CD40分子在IBD中的作用。,吉林工程技術(shù)師范學院 討論,,,

28、結(jié)論,通過本實驗證實RNAi干預(yù)技術(shù)能夠有效的干預(yù)大鼠樹突狀細胞CD40分子的表達。試驗組較對照組CD40分子的mRNA表達量下調(diào)了57.21%。蛋白表達亦明顯降低，抑制率為60%（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。這一結(jié)果為IBD RNA干預(yù)治療的動物實驗及臨床應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ) 。,吉林工程技術(shù)師范學院