聚合本酶鏈式反應(yīng)pcr技術(shù)講座

1、PCR技術(shù),侯云鵬 2013.11.10,1.PCR概述2.PCR反應(yīng)的原理和步驟3.PCR的反應(yīng)動力學(xué)4.PCR反應(yīng)體系的主要成分和作用5.PCR的反應(yīng)條件控制6.PCR反應(yīng)的特點7.防止PCR錯誤擴增的措施8.PCR常見問題及解決辦法9.常規(guī)PCR技術(shù)及幾類PCR新技術(shù),一、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）概述,（一）概念 聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaciton, P

2、CR)，即PCR技術(shù)，是近年來發(fā)展起來的一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。,（二）發(fā)展歷程1971年 Kjell Kleppe提出PCR原始雛形 概念1983年 Kary Mullis發(fā)明PCR技術(shù)1987年 獲得專利1993年 諾貝爾化學(xué)獎,PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。 PCR由變性--退火--延伸

3、三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：,二、PCR反應(yīng)的原理和步驟,1、模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備； 2、模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；,3、引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原

4、料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈。 重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的片段富集106～109倍。所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。,,變性,,,,,,,,,,退火,引物,,經(jīng)25~30次循環(huán)，目的DNA增加106-9,PCR反應(yīng)過程示意圖,,Y

5、= Y0 * (1+X)n,Y:擴增拷貝數(shù)量Y0:起始模板數(shù)量X：擴增效率n:擴增循環(huán)數(shù),PCR 理論方程,三、PCR的反應(yīng)動力學(xué),PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應(yīng)中平均效率達不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺期。,

6、四、PCR反應(yīng)體系的主要成分和作用,DNA聚合酶模板引物dNTP緩沖體系,（一）DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶來源于嗜熱水生菌的重組體，與一般的聚合酶所不同的是在高溫狀態(tài)仍具有活性。 可分為兩大類： 1、具有校正功能的（有3’→5’核酸酶活性） 比如：Vent,pfu,pwo等 2、不具有校正功能的 （無3’ →5’核酸酶活性） 比如：一般的Taq DNA聚合酶,（二）模板 核

7、酸模板的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。,（三）引物 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板D

8、NA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。,設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則： 1、引物長度一般15-30個bp，常用為20bp左右。引物過短過長都會使特異性降低。 2、引物擴增跨度以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。 3、引物堿基G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。堿基隨機分布，避免5個以上的相同核苷酸的成串排列。 4、

9、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。,5、引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。 6、引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。 7、引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物

10、濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。,（四）dNTP的質(zhì)量與濃度　 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。,（五）PCR反應(yīng)緩沖液　組成：50mM KCl 10mM Tr

11、is.Cl (pH 8.4) 1.5mM MgCl2 Mg2+是Taq酶活性所必需的金屬離子。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。,（六）PCR反應(yīng)標(biāo)準體系,五、PCR的反應(yīng)條件控制,（一）PCR反應(yīng)的溫度和時間控制 1、變性溫度與時間 變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR

12、失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致PCR失敗。,2、退火(復(fù)性)溫度與時間 退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

13、 復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。,,3、延伸溫度與時間： PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。 PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DN

14、A片段，延伸時間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。,（二） PCR反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)控制　　 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。,六、PCR反應(yīng)的特點,1、特異性強 PCR反應(yīng)的

15、特異性決定因素為引物與模板DNA特異正確的結(jié)合、堿基配對原則、TqDNA聚合酶合成反應(yīng)的正確度、靶基因的特異性與保守性。 2、靈敏度高 PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的。 3、簡便快速 PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性、退火、延伸反應(yīng)，一般在2～4h完成擴增反應(yīng)。 4、對標(biāo)本的純度要求低 不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞

16、，DNA粗制品及總DNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等粗制的DNA擴增檢測。,1、隔離操作、戴不受污染的手套2、試劑的配制、分裝和保存3、開蓋前先離心，小心開蓋和上蓋。4、加樣時最后加模板DNA5、設(shè)立對照實驗6、注意其他操作過程中可能造成的污染,七、防止PCR錯誤擴增的措施,八、PCR常見問題及解決辦法,（一）擴增不出特異性帶 1、原因 （1）引物設(shè)計有問題（引物位置錯

17、誤，引物之間太強的相互作用） （2）反應(yīng)體系有問題 （3）退火溫度太高 2、解決辦法 （1）確認引物正確性 （2）用保證能擴增出來的引物驗證反應(yīng)體系 （3）采用梯度PCR功能，尋找最適合的退火溫度,（二）擴增帶很弱 1、原因 （1）反應(yīng)體系效率低 （2）退火溫度太高 （3）很多非特異性擴增 （4）大量引物二聚物的形成 2、解決辦法 （1）用已確認的引物驗證 （2）采用梯度P

18、CR功能尋最適的退火溫度 （3）采用定量PCR的熔點曲線功能分析，提高退火溫度，改變反應(yīng)體系的PH值,（三）非特異性擴增帶很多 1、原因 （1）退火溫度太低 （2）反應(yīng)體系有問題 2、解決辦法 （1）采用梯度PCR功能尋找最佳反應(yīng)溫度 （2）更換反應(yīng)體系,（四）引物二聚物太多 1、原因 （1）引物設(shè)計有問題 （2）反應(yīng)體系有問題 （3）退火溫度太低 2、解決辦法 （1）重新設(shè)計引物

19、 （2）調(diào)整和更換反應(yīng)體系 （3）用梯度PCR尋找最佳的退火溫度,（五）結(jié)果的重現(xiàn)性差 1、原因 反應(yīng)體系發(fā)生了變化 2、解決辦法 用熒光定量PCR儀熔點曲線功能分析PCR的結(jié)果，看非特異性產(chǎn)物和引物二聚物,九、常規(guī)PCR技術(shù)及幾類PCR新技術(shù),溫度梯度PCR 不對稱PCR熱啟動PCR 原位PCRTouch-down PCR 連接酶鏈反應(yīng)RT-P

20、CR RACE-PCR熒光定量PCR AFLP兼并引物PCR 巢氏PC免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCRMSP甲基化特異 PCR,溫度梯度PCR,溫度梯度曲線,Thermal Image of 45-65°C Gradientacross a PTC-200 with a 96-well Alpha,溫度梯度PCR優(yōu)化復(fù)性

21、溫度,,Gradient optimization of 12 different temperatures across the block, tested between 48°C and 68°C,,手動熱啟動法管底：DNA、預(yù)冷buffer、dNTP和dH2O 管壁：引物預(yù)熱：80℃加Taq酶，離心，開始PCR循環(huán)。專用熱啟動酶法抗體介導(dǎo)的抑制DNA聚合酶法化學(xué)阻斷DNA聚合酶法其他DN

22、A聚合酶抑制劑法,（三）Touch-down PCR1、概念： Touch-down PCR又稱降落PCR。即選定一個溫度范圍，如50-35℃，每降1-2℃進行1-2個循環(huán)，然后在50度下進行15個循環(huán)。2、原理： 隨著退火溫度的降低，特異性逐步降低，但特異性條帶在溫度較高時已經(jīng)擴增出來，其濃度遠遠超過非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優(yōu)先被擴增。,3、選擇初始復(fù)性溫度的原則： 起始復(fù)性溫度應(yīng)該比

23、引物的Tm值高出5-10度，然后每個循環(huán)遞減1-2度。4、Touch-down PCR的應(yīng)用范圍模板DNA濃度較低; 引物簡并程度高或特異性低; RT-PCR時使用oligo-dT。,（四）RT-PCR1、概念： RNA的多聚酶反應(yīng)（RT-PCR）是以RNA為模板，聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（reverse transcription，RT）與PCR，可用于檢測單個細胞或少數(shù)細胞中少于10個拷貝的RNA模板。2、RNA擴增包括

24、兩個步驟：（1）在單引物的介導(dǎo)下和逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成RNA的互補cDNA（2）加熱后cDNA與RNA鏈解離，然后與另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成雙鏈靶DNA，最后擴增靶DNA,RT-PCR,RT-PCR,,(2) 置換合成法 該方法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的cDNA-mRNA雜交鏈不經(jīng)變性,而是dNTP存在下,利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產(chǎn)生一系列RNA引物,使之成

25、為合成第二鏈的引物,在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二鏈。 該反應(yīng)有3個主要優(yōu)點: ①非常有效; ②直接利用mRNA鏈,無須進一步處理和純化; ③不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。,4、RT-PCR特殊條件（1）模板： 作為模板的RNA分子必須是完整的，并且不含DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。RNA中即使含有最微量的DNA，經(jīng)擴增后也會出現(xiàn)非特異性擴增；蛋白若未除干凈，與RNA結(jié)合后會影響逆轉(zhuǎn)

26、錄和PCR；殘留的RNase極易將模板RNA降解掉。,（2）引物：上下游引物設(shè)計在跨內(nèi)含子的兩個外顯子的3’端和下一個外顯子的5’端，這樣不會在基因組上擴出來。設(shè)計在兩個離得遠的外顯子上，這樣從基因組和cDNA上得到的片段長度不一樣，可以一物兩用。,5、RT-PCR方法：一步法和兩步法（1）一步法： 在同一緩沖液體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、Taq酶、4種dNTP直接進行mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴增。另外Taq酶不僅具有DNA

27、多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄和其后PCR擴增，從而使mRNA的PCR步驟更為簡化。 特點：所需樣品量少，可檢測出總RNA中小于1ng的低豐度mRNA?？捎糜谂R床小樣品的檢測、低豐度mRNA的cDNA文庫的構(gòu)建及特異cDNA的克隆，并有可能與Taq酶的測序技術(shù)相組合。,（2）兩步法： 由于單管反應(yīng)時RT和PCR都不能在最佳條件下進行并且容易相互干擾，常只適宜

28、用基因特異引物擴增較短的基因及定量PCR，兩步法則是將RT和PCR分別進行。 特點：兩步法使得兩個反應(yīng)分開，能夠充分發(fā)揮各自的特點，更為靈活而且嚴謹，適合那些GC含量、二級結(jié)構(gòu)嚴重的模板或者是未知模板，以及多個基因的RT-PCR。,RT-PCR中的一步法和兩步法比較,一步法 兩步法引物：Gene-specific Oligo(dT)

29、 Random hexamers Gene-specific優(yōu)點：方便，不易污染 靈活性應(yīng)用：大量樣本分析 GC含量、二級結(jié)構(gòu)嚴重 低豐度mRNA的RT-PCR 的模板或者是未知模 實時定量RT-PCR

30、 板，以及多個基因的 RT-PCR。,（五）熒光定量PCR 1、概念： 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準曲線對未知模板進行定量分析的方法。,擴增產(chǎn)物的相對熒光強度達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)。,Ct值的定義,,,Ct,起始DNA拷貝數(shù),CT值與起始DNA拷貝數(shù)的關(guān)系,Ct = -k

31、logX0 + b,閾值 = 基線（背景）信號均值＋基線（背景）信號標(biāo)準偏差 x 10基線的范圍：從第3個循環(huán)起到指數(shù)增長開始前3個循環(huán)止。一般取3-15循環(huán)。,基線和閾值的確定,,,,,基線,,閾值,標(biāo)準偏差,,3個循環(huán),,2、熒光PCR的方法,（1）插入染料法（2）雜交探針法TaqMan 探針分子信標(biāo)探針（Molecular Beacons）FRET探針,d.NTPs,Taq酶,Primers,反應(yīng)組分,變 性

32、,,插入染料方法的原理,插入染料,l,,,延 伸,檢測激發(fā)的熒光,,退 火,SYBR Green激發(fā)波長495nm，檢測波長520nm。SYBRGreen染料插入雙鏈DNA，檢測靈敏度提高200倍。相對雜交探針方法，插入染料法相對較便宜。和雜交探針方法相比，插入染料法特異性低 。,最常用的插入染料,TaqMan探針,d.NTPs,Taq酶,Primers,反應(yīng)體系,變 性,,l,,退 火,1. 鏈取代,2. 水

33、解,3. 聚 合,4. 檢測熒光,l,,,,TaqMan探針的設(shè)計原則,Tm大于引物Tm10℃5’末端不能是G,分子信標(biāo)(Molecular Beacons),,1. 鏈替換,2. 聚合完成,l,退 火,,FRET 探針,l,退 火,,鏈替換,熒光熄滅,,1-5 bases,常用的熒光基團,,,,,Absorbance (nm),Emission (nm),552,570,643,667,494,52

34、5,535,556,521,520,536,548,565,580,583,603,,,,,,多色熒光檢測技術(shù) ——同時檢測4色熒光,3、熒光定量PCR的應(yīng)用,相對定量：基因在不同組織中的表達差異、藥物療效考核絕對定量：基因表達研究、病原體檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測,相對定量,參考基因：Actin, GAPDH, 18sRNA,1．計算ΔCt：ΔCt=Ct 靶基因－Ct GAPDH，分別計算實驗組和對照組的ΔCt。2．

35、計算ΔΔCt：ΔΔCt=ΔCt實驗組－ΔCt對照組，本例中ΔΔCt= －4.4。3．計算相對表達量的差值。2 －ΔΔCt,絕對定量,構(gòu)建標(biāo)準曲線：A、按照擴增片段的序列，人工合成一段寡聚核苷酸。B、利用純化的擴增產(chǎn)物制備 C、克隆有擴增產(chǎn)物的質(zhì)粒 標(biāo)準品的選擇：標(biāo)準品可以從廠家購買，也可以自己制備標(biāo)準品的單位，取決于對最終結(jié)果的要求：拷貝數(shù)，%，ng/uL, mol/uL（如：如果要得出的是樣品中的基因拷貝數(shù)，則梯度稀釋

36、已知摩爾濃度的DNA）,,熒光強度的校正影響熒光信號強度的因素包括：光源強度、管蓋透光性能緩沖液用量、反應(yīng)體積、PCR反應(yīng)強度等等以擴增前的熒光探針本底信號為依據(jù)，熒光強度歸一化校正。內(nèi)參照熒光Rox校正。PCR擴增效率的校正利用多色熒光檢測技術(shù)對內(nèi)標(biāo)熒光的檢測可校正PCR擴增效率誤差。,實驗誤差校正技術(shù)——準確定量,（六）兼并引物PCR（Degenerate Primer）,1、密碼子的兼并性氨基酸　　　　　　　　　

37、　　　　　　　密碼子數(shù)Ｍ、Ｗ　　　　　　　　　　　　　　　　　?。保谩ⅲ?、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｙ　　　?。玻伞　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。常?、Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｖ　　　　　　　　　　　　４Ｌ、Ｒ、Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　６,2、概念 兼并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。兼并度越低，產(chǎn)物特異性越強。設(shè)計引物時應(yīng)盡量選擇兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，因為

38、3'端最后3個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR；次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。,（七）巢氏PCR（Nested PCR）,巢氏PCR需要兩到三對引物，一般采用第一套引物擴增15-30個循環(huán)，再用擴增DNA片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴增15-30個循環(huán)，這樣可使待擴增序列得到高效擴增，而次級結(jié)構(gòu)卻很少擴增。套式引物PCR減少了引物非特異性退火，從而增加了特異性擴增，提高了擴增效率。 若將套失PCR的內(nèi)外引

39、物稍加改變，延長外引物長度（25-30bp），同時縮短內(nèi)引物長度（15-17bp），使外引物先在高退火溫度下復(fù)性，做雙溫擴增，然后改換至三溫循環(huán)，使內(nèi)引物在外引物擴增的基礎(chǔ)上，在低退火溫度復(fù)性，直到擴增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時加入。,（八）反向PCR（Inverse PCR）,1、概念 反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。反向PCR可

40、用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又稱為染色體步移。這時選擇的引物雖然與核心DNA兩末端序列互補，但引物3’端是相互反向的。2、反向PCR的操作流程： 擴增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個環(huán)狀分子，通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段。,Inverse PCR,,,,,,限制酶切點（X）,限制酶切點（X）,已知序列,,,限制酶X酶切,連接,,,,,引物2,引物1,,PCR,

41、,,,（九）不對稱PCR（Asymmetric PCR）,1、不對稱PCR的基本原理： 采用不等量的引物產(chǎn)生大量的單鏈DNA（ss-DNA）。這兩種引物分別稱為限制性引物與非限制性引物；其最佳比例一般為1:50-1:100，關(guān)鍵是限制引物的絕對量。限制性引物太多太少，均不利于ss-DNA。2、不對稱PCR反應(yīng)過程： 一般來說，在不對稱PCR反應(yīng)中，在開始的20-25個循環(huán)中，兩個比率不對稱的擴增引物產(chǎn)生出雙鏈DNA，當(dāng)

42、限量的那個引物耗光后，隨后的5-10個循環(huán)就產(chǎn)生出ssDNA。產(chǎn)生的ds-DNA與ss-DNA由于分子量不同，可以通過電泳分離。,（十）原位PCR,1、概念： 原位PCR就是在組織細胞里進行PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點，是細胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項有較大潛力的新技術(shù)。2、特點　 原位PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細胞，又能標(biāo)出靶序列在細胞內(nèi)的位置，于分子和細胞水平上研

43、究疾病的發(fā)病機理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)歸有重大的實用價值，其特異性和敏感性高于一般的PCR.,,,,3、基本方法： ①固定組織或細胞:將組織細胞固定于預(yù)先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，再滅活除去細胞內(nèi)源性過氧化物酶。 ②蛋白酶K消化處理:用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細胞片55℃消化處理2h后，96℃2min以滅活蛋白酶K。 ③PCR擴增:在組織細胞片上，加PCR反應(yīng)液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴增儀

44、的金屬板上，進行PCR循環(huán)擴增。 ④雜交:PCR擴增結(jié)束后，用標(biāo)記的寡核苷酸探針進行原位雜交。 ⑤顯微鏡觀察結(jié)果。,原位PCR,（十一）連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reaction，LCR),1、LCR的基本原理： 利用DNA連接酶特異地將雙鏈DNA片段連接，經(jīng)變性-退火-連接三步驟反復(fù)循環(huán)，從而使靶基因序列大量擴增。 2、應(yīng)用　 目前LCR主要用于點突變的研究與檢測、微生物病原體的檢測及定

45、向誘變等，還可用于單堿基遺傳病多態(tài)性及單堿基遺傳病的產(chǎn)物診斷，微生物的種型鑒定，癌基因的點突變研究等。,3、反應(yīng)程序:首先加熱至一定溫度下(94～95℃)使DNA變性，雙鏈打開；然后降溫退火(65℃)，引物與之互補的模板DNA結(jié)合并留下一缺口；如果與靶序列雜交的相鄰的寡核苷酸引物與靶序列完全互補，DNA連接酶即可連接封閉這一缺口，則LCR反應(yīng)的三步驟(變性-退火-連接)就能反復(fù)進行，每次連接反應(yīng)的產(chǎn)物又可在下一輪反應(yīng)中作模板，使更

46、多的寡核苷酸被連接與擴增。若連接處的靶序列有點突變，引物不能與靶序列精確結(jié)合，缺口附近核苷酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接反應(yīng)不能進行，也就不能形成連接產(chǎn)物。,,,,,,,,,,Ligase chain reaction (LCR),,,,,,Denaturation 70C,Annealing and Ligation 40C,Denaturation 70C,,,,,,,,,,,,cDNA末端快速擴增技術(shù)是一種基

47、于PCR從低豐度的轉(zhuǎn)錄本中快速擴增cDNA的5‘和3’末端的有效方法。 RACE可以分為兩類： 5’ RACE-PCR 3’ RACE-PCR,（十二）cDNA末端快速擴增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends, RACE）,,,利用mRNA的3’末端的poly(A)尾巴作為一個引物結(jié)合位點，以O(shè)ligo(dT)30MN作為鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶MMLV作用下，反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準第一鏈cDNA。利用該反

48、轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在反轉(zhuǎn)錄達到第一鏈的5‘末端時自動加上3一5個(dC)殘基，退火后(dC)殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接頭引物配對后，轉(zhuǎn)換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭(figure 2 )。然后用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作為上游引物，用一個基因特異引物2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作為下游引

49、物，以SMART第一鏈cDNA為模板，進行PCR循環(huán)，把目的基因5‘末端的cDNA片段擴增出來。最終，從2個有相互重疊序列的3' / 5‘-RACE產(chǎn)物中獲得全長cDNA，或者通過分析RACE產(chǎn)物的3‘和5‘端序列，合成相應(yīng)引物擴增出全長cDNA。,5’ RACE-PCR,,,利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作為一個引物結(jié)合位點，以連有SMART寡核營酸序列通用接頭引物的Oligo(dT)30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成

50、標(biāo)準第一鏈cDNA。然后用一個基因特異引物GSP1(gene specific primer,GSP)作為上游引物，用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作為下游引物，以cDNA第一鏈為模板，進行PCR循環(huán)，把目的基因3‘末端的。DNA片段擴增出來。,3’ RACE-PCR,,,（1）是利用鎖定引物((lock docking primer)合成第一鏈cDNA,即在oligo(dT)引物的3‘

51、端引入兩個簡并的核苷酸【5’-Oligo(dT)16_30MN-3‘, M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始點，從而消除了在合成第一條cDNA鏈時oligo(dT)與poly(A)尾的任何部位的結(jié)合所帶來的影響;（2）在5‘端加尾時，采用poly(C)，而不是poly(A);（3）采用RNase H一莫洛尼氏鼠白血.病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶或選擇嗜熱DNA聚合酶可能在高溫h (60 度 -70度

52、)有效地逆轉(zhuǎn)錄mRNA，從而消除了5‘端由于高CC含量導(dǎo)致的mRNA 二級結(jié)構(gòu)對逆轉(zhuǎn)錄的影響;（4）是采用熱啟動PCR (hot start PCR)技術(shù)和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反應(yīng)的特異性。,RACE-PCR,AFLP技術(shù)是一項新的分子標(biāo)記技術(shù)，是基于PCR技術(shù)擴增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結(jié)合

53、位點。限制性片段用二種酶切割產(chǎn)生，一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。它結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性。由于AFLP擴增可使某一品種出現(xiàn)特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶產(chǎn)生，因此，這種通過引物誘導(dǎo)及DNA擴增后得到的DNA多態(tài)性可做為一種分子標(biāo)記。AFLP可在一次單個反應(yīng)中檢測到大量的片段。以說AFLP技術(shù)是一種新的而且有很大功能的DNA指紋技術(shù)。,（十三）AFLP（擴增性片段長

54、度多態(tài)性 ）,AFLP,1、概念： 免疫-PCR是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測系統(tǒng)。它利用抗原-抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴增反應(yīng)的極高靈敏性來檢測抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測。2、免疫PCR優(yōu)點　　　?、偬禺愋暂^強，因為它建立在抗原抗體特異性反應(yīng)的基礎(chǔ)上。②敏感度高，PCR具有驚人的擴增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于單個抗原的檢測。③操作簡便，PCR擴增質(zhì)粒DNA比擴增靶基因容易得多，

55、一般實驗室均能進行。,（十四）免疫-PCR(immuno-PCR),3、主要步驟 ①抗原-抗體反應(yīng)； ②與嵌合連接分子結(jié)合； ③PCR擴增嵌合連接分子中的DNA(一般為質(zhì)粒DNA)。 4、關(guān)鍵環(huán)節(jié) 免疫-PCR技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是嵌合連接分子的制備。嵌合連接分子起著橋梁作用，它有兩個結(jié)合位點，一個與抗原抗體復(fù)合物中的抗體結(jié)合，一個與質(zhì)粒DNA結(jié)合，其基本原理與ELISA和免疫酶染色相似，不同之處在于其中的標(biāo)記物

56、不是酶而是質(zhì)粒DNA，在操作反應(yīng)中形成抗原抗體-連接分子-DNA復(fù)合物，通過PCR擴增DNA來判斷是否存在特異性抗原。,,,（十五）MSP甲基化特異PCR,一般調(diào)控區(qū)保持甲基化狀態(tài)，基因不表達直接干擾轉(zhuǎn)錄因子和啟動子識別位點的結(jié)合與轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合引起基因沉默改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu),概念： MSP甲基化特異PCR是用對苯二酚和亞硫酸氫鈉處理氫氧化鈉變性的基因組DNA，使得未甲基化的C轉(zhuǎn)化為T。按照C轉(zhuǎn)換T后的基因序列設(shè)計出