定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)熒光檢測技術(shù)研究.pdf

1、定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR，Quantitative Polymerase Chain Reaction)技術(shù)是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET，F(xiàn)luorescence Resonance Energy Transfer)的原理，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測PCR進(jìn)程中每個反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板數(shù)進(jìn)行定量分析的技術(shù)。為實現(xiàn)擴(kuò)增模板的準(zhǔn)確定量，需要嚴(yán)格控制PCR試劑的反應(yīng)時間和

2、反應(yīng)溫度;還需要對反應(yīng)過程中試劑發(fā)出的熒光信號進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析，包括能檢測到微安級微弱信號的光學(xué)系統(tǒng)和實現(xiàn)熒光數(shù)據(jù)定量描述的熒光信號監(jiān)測系統(tǒng)。
　　定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)包括實現(xiàn)目標(biāo)基因快速擴(kuò)增的熱循環(huán)系統(tǒng)和實現(xiàn)目標(biāo)基因準(zhǔn)確定量的熒光檢測系統(tǒng)。其中用于檢測熒光信號的光學(xué)系統(tǒng)，是實現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物定量檢測的核心元件?；趥鹘y(tǒng)的共聚焦式熒光檢測光路，本文提出了Y光纖型光學(xué)系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用光纖的全反射原理，通過將激發(fā)光以全反射的形式引入Y光

3、纖激發(fā)分支并激發(fā)熒光試劑發(fā)出熒光，再由光纖的發(fā)射分支接收熒光信號送至光電轉(zhuǎn)換器，由于沒有引入過多的傳統(tǒng)光學(xué)器件，因此大大降低了光線在傳輸過程中能量的損耗。通過光學(xué)軟件ZEMAX仿真對影響Y光纖型光學(xué)系統(tǒng)傳輸效率的影響因素進(jìn)行了分析，包括光源、透鏡參數(shù)、光纖數(shù)值孔徑和光纖損耗等;并結(jié)合實際熒光檢測實驗，對比基于共聚焦式和基于Y型光纖的熒光檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果，驗證了Y光纖型光學(xué)系統(tǒng)的有效性。
　　該光學(xué)系統(tǒng)對96孔樣品塊進(jìn)行掃描式檢測，

4、為避免光學(xué)系統(tǒng)與熱循環(huán)系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)上的相互干涉，本文采用相互正交的雙螺桿電動臺分別帶動光學(xué)模塊和熱循環(huán)模塊作直線運動以完成熒光的激發(fā)和收集過程。
　　由光學(xué)系統(tǒng)捕捉到的熒光數(shù)據(jù)非常微弱，一般處于微安量級，并摻雜有噪聲信號，因此在將模擬信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號之前需要對采集到的熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行放大濾波處理，再通過數(shù)據(jù)采集卡對處理得到的模擬電壓信號進(jìn)行A/D轉(zhuǎn)換送至上位計算機(jī)的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。為完成擴(kuò)增模板的準(zhǔn)確定量，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)字

5、濾波處理以進(jìn)一步去除信號中的噪聲干擾，并通過五點三次數(shù)據(jù)平滑處理提高曲線擬合效果，最后按照加載的定量算法求得目標(biāo)基因在各個循環(huán)的擴(kuò)增量和起始拷貝數(shù)從而實現(xiàn)擴(kuò)增片段的定量檢測。
　　基于Liu&Saint S型曲線模型，提出了改進(jìn)型定量算法，該算法考慮了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程中每個循環(huán)擴(kuò)增效率的動態(tài)性能，因此對熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析更為科學(xué)客觀。
　　通過使用本課題所研發(fā)的定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)進(jìn)行熒光檢測和基因定量實驗可以得出，采