用于檢測尿液中hiv抗體的膠體金免疫層析快速診斷試紙條的制備_李曉娜

1、[作者簡介]李曉娜(1980)女碩士講師主要從事生物檢測技術和有機化學合成研究。＊通訊聯(lián)系人Email:yfguan@mail.cmu.edu.cn【微生物檢測方法】用于檢測尿液中HIV抗體的膠體金免疫層析快速診斷試紙條的制備李曉娜12趙曉陽13郭亮1王彪1郝鳳進1關一夫1＊(1.中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室沈陽1100012.中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院化學教研室沈陽1100013.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院化學教研室沈陽11

2、0001)[摘要]目的:制備一種可以通過檢測尿液中HIV抗體來進行無創(chuàng)傷HIV感染的膠體金免疫層析快速診斷試紙條。方法:利用檸檬酸三鈉還原法制備直徑38nm的膠體金溶液利用HIV1gp41抗原標記膠體金制備膠體金免疫復合物組裝膠體金免疫層析快速診斷試紙條。結果:膠體金顆粒粒徑均一膠體金免疫復合物性能穩(wěn)定特異性強試紙條檢測時間只需10～20min。結論:膠體金免疫層析試紙條使用簡便檢測快速結果準確無需特殊的儀器設備性價比高適用于基層醫(yī)療單

3、位使用和對大量人群的規(guī)模篩查等。[關鍵詞]HIV檢測膠體金免疫層析尿液標本快速檢測[中圖分類號]R446.6[文獻標識碼]A[文章編號]10048685(2009)04082304PreparationofcolloidalgoldimmunochromatographictestkitforquicklydiagnosingHIVantibodyinurineLIXiaona12ZHAOXiaoyang13GUOLiang1WANGB

4、iao1HAOFengjin1GUANYifu1＊(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiologyCollegeofBasicMedicalScienceChinaMedicalUniversityShenyang110001China2.DepartmentofChemistryCollegeofBasicMedicalScienceChinaMedicalUniversityShenyan

5、g110001China3.DepartmentofChemistryCollegeofBasicMedicalScienceShenyangMedicalUniversityShenyang110001China)[Abstract]Objective:TodevelopthecolloidalgoldimmunochromatographictestkitforquicknoninvasivediagnosisofHIVinfect

6、ionbytestingHIVantibodyinurine.Methods:Preparingthecolloidalgoldparticlesof38nmindiameterusingamethodofcitratetrisodiumimmobilizingHIV1gp41antigenoncolloidalgoldparticlesandassemblingthetestkit.Results:Colloidalgoldparti

7、clesareuniformthecolloidalgoldimmunocomplexisstablewithastrongspecificity.Testingresultscanbeobtainedin10～20minutes.Conclusion:Thecolloidalgoldimmunochromatographictestkitisconvenientinusewithfasttestingspeedandaccurater

8、esult.Thetestingresultcanbereadeasilywithoutanyassistanceofspecialapparatusandinstruments.Ithaspotentialutilityinfastmedicaldiagnosesandquickscreeningofmasspopulation.[Keywords]HIVdetectionColloidalgoldimmunochromatograp

9、hyUrinespecimenQuickdetectio艾滋病(AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的一種免疫缺陷性疾病近十幾年來在我國迅速蔓延。由于目前還沒有很好的預防性疫苗和治療方法早期診斷是預防艾滋病傳播的最佳方案。對艾滋病患者和可疑人群的普查和管理通常在指定的醫(yī)院和檢驗檢疫機構進行血液檢查。常用的HIV初篩方法有膠體金側流層析法(LFC)、核酸法(NAT)、明膠顆粒凝集法(PA)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)。但是上述的檢測

10、方法都需要在國家認定的檢驗實驗室中進行(采集血樣、處理樣品和檢測)而且在血液標本采集過程中還存在著醫(yī)護人員和被檢測者會因針刺意外而感染艾滋病毒的危險。因此這些現(xiàn)有的檢測檢驗方法都不便于對艾滋病患者實施長期的、追蹤式的、常規(guī)化檢測和對可疑人群實施規(guī)?；钠詹楹秃Y查。研究發(fā)現(xiàn)HIV病毒攜帶者的尿液中均含有抗艾滋病病毒的抗體這為我們提供了一個通過檢測尿液中的HIV抗體來判斷被檢人員的HIV病毒感染狀態(tài)的可能。20世紀80年代興起的膠體金免疫層

11、析檢測(goldimmunochromagraphyassayGICA)操作簡單快捷、結果清晰易于判斷、無需復雜的實驗技能和特殊設備。其原理是基于抗原抗體之間的特異性反應。在硝酸纖維素膜上預先固定好特異性抗原(或抗體)和抗體做為2種捕獲劑分別作為檢測線(T線)和質控線(C線)[1]。反應物是固定于膠體金結合墊上并標記了待測物抗原的膠體金顆粒。將樣品液滴加在試紙條的樣品墊上樣品液先溶解固定在膠體金結合墊上的膠體金并與樣品液中的待測物抗體形

12、成復合物。當溶液在毛細管作用下到達T線時T線上的抗原與待測物抗體膠體金復合物再次發(fā)生特異性結合從而橋連膠體金被截留在T線上聚集并顯示出顏色[23]。因此可以根據(jù)試紙條T線的顏色深淺或有無來判斷樣品中是否含有待測物。該方法還是進行定性或半定量檢測的一種有效途徑[4～6]。本實驗研究報道了利用膠體金免疫層析法對尿液進行HIV抗體檢測的結果并由此制823中國衛(wèi)生檢驗雜志2009年4月第19卷第4期ChineseJournalofHealthL

13、aboratoryTechnologyApr2009Vol19No4圖338nm膠體金顆粒、HIV1gp41抗原以及HIV1gp41抗原標記的膠體金顆粒的紫外可見吸收光譜2.2HIV1gp41抗原標記膠體金復合物的制備與純化按前述方法將膠體金溶液pH值調至7.5加入HIV1gp41抗原攪拌15min在磁力攪拌過程中加入BSA達終濃度后冷卻將標記好的膠體金溶液超速離心棄沉淀后將上清再次離心小心地吸去上清其沉淀物即為初步純化的膠體金HIV抗

14、原復合物。將以此得到的超速離心純化后的膠體金HIV抗原復合物在透射電鏡下觀察。圖4是放大倍數(shù)為100萬倍的透射電鏡下觀察到的未標記的膠體金顆粒和HIV1gp41抗原標記的膠體金顆粒的圖像。兩者對比可以觀察到HIV1gp41抗原標記膠體金復合物外圍有明顯的低電子密度暈圈表明膠體金顆粒表面吸附有蛋白質。利用紫外可見光分光光度計在200～800nm進行掃描測定的吸收曲線中不僅有膠體金的特征吸收峰而且還有蛋白質的特征吸收峰(圖3)與單純的蛋白質

15、的特征吸收峰相比兩峰位置是一致的(λmax=280nm)。A:未標記的膠體金顆粒(標尺是50nm)B:HIV1gp41抗原標記的膠體金顆粒(標尺是100nm)圖4透射電鏡下的膠體金顆粒形態(tài)2.3臨床尿液標本中HIV1抗體的檢測實驗方法參見《國家藥品監(jiān)督管理局令第3號》附件二:新生物制品申報資料項目(三)外診斷用品申報資料項目說明。200份受檢尿樣中HIV1gp41膠體金法陽性102份陰性98份ELISA法陽性100份陰性100份。表2試

16、紙條性能參數(shù)檢測試驗結果實驗真陽性真陰性合計檢測陽性100(A)2(B)102(AB)檢測陰性0(C)98(D)98(CD)總數(shù)100(AC)100(BD)200(ABCD)2.3.1真實性指標(1)靈敏度(真陽性率)=A(AC)100%=100(1000)100%=100%(2)特異度(真陰性率)=D(BD)100%=98(298)100%=98%(3)假陽性率=B(BD)100%=2(298)100%=2%(4)假陰性率=C(AC)

17、100%=0(1000)100%=0(5)粗一致率=(AD)(ABCD)100%=198200100%=99%(6)調整一致率=14〔A(AB)A(AC)D(CD)D(BD)〕100%=99%(7)約登指數(shù)=A(AC)D(BD)1=0.982.3.2預示值指標(1)陽性試驗的預示值=A(AB)100%=100(1002)100%=98%(2)陰性試驗的預示值=D(CD)100%=98(098)100%=100%經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)該試紙條特異性較

18、好與其它物質無交叉反應。三批試紙條檢測同一標本及同一批次的試紙條檢測不同標本3次檢測結果均穩(wěn)定。試紙條在4℃條件下保存90d室溫下保存75d37℃下保存15d檢測結果未發(fā)生改變。組裝好的試紙條置于相對濕度為40%～80%溫度18℃～25℃的含有干燥劑的鋁箔袋中保存?zhèn)溆谩Ｔ嚰垪l雖然可在室溫下保存但大批暫時不用的試紙條應該放在4℃保存以免抗體失效。從冰箱剛取出的試紙條應待其恢復至室溫然后再打開密封避免試紙條凝集空氣中的水分造成T線模糊不清。

19、3討論本研究利用檸檬酸鈉還原法制備了膠體金顆粒利用HIV1gp41抗原對膠體金顆粒進行了標記。然后我們制備了快速診斷HIV感染的膠體金免疫層析試紙條并以此對尿液樣本中的抗HIV1gp41抗體進行了檢測。臨床檢驗結果已經(jīng)證實了該膠體金免疫層析試紙條可以通過檢測尿液中HIV抗體實現(xiàn)快速和安全地診斷被檢人員HIV的感染程度。和ELISA方法相比兩者的敏感性與特異性無差別。利用ELISA方法檢測時每一塊酶標板一次可以檢測92人份樣品。但是ELI

20、SA檢測方法操作步驟繁雜必須由專業(yè)技術人員操作完成僅適用于醫(yī)院和檢驗檢疫部門等。而NAT檢測方法對技術要求高特別是血篩用對靈敏度要求更高標本留樣和處理比較困難檢測之前病毒核酸容易降解造成假陰性檢測結果。聚集的膠體金顆粒呈現(xiàn)出肉眼可見的顏色檢測時不需要特殊的儀器和設備即可判讀結果。膠體金免疫層析試紙條法簡易便捷無需復雜步驟個人能獨立完成檢測成本較低使得消費者更易于接受。無需洗滌不形成免疫復合物的標記抗原通過層析作用自動分離既簡化了操作步驟

21、又減少了影響實驗結果的干擾因素。該試紙條可以在5～10min內(nèi)完成檢測樣品處理方法簡便、操作靈活、運輸方便而且試紙條自帶質量控制線實驗結果一目了然為現(xiàn)場檢測提供了最方便適用的檢測手段特別適合于廣大醫(yī)療檢驗檢疫人員和基層醫(yī)療人員使用以及大批量檢測和人群普查等具有簡便、快速、特異、敏感、穩(wěn)定等特點因此該技術具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻们熬?。在實際工作中一(下轉第888頁)825中國衛(wèi)生檢驗雜志2009年4月第19卷第4期ChineseJourn