尿液檢測HIV抗體膠體金免疫層析快速診斷試紙條的研制以及pET28a-gp41重組質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)是由人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染所致的以循環(huán)CD4+T細胞顯著下降、機會感染及惡性疾病為特征的繼發(fā)性免疫缺陷綜合征。在HIV感染后，最先能夠監(jiān)測到的是病毒RNA、然后是p24抗原，最后是抗體。在全世界范圍早期對HIV的檢測主要是通過血清學試驗檢測抗HIV的抗體，間接地診斷HIV感

2、染。 檢測血液中的抗HIV抗體一直被認為是診斷AIDS的前提。傳統(tǒng)的血液檢測法對醫(yī)院的環(huán)境設施及相關(guān)醫(yī)務人員水平有較高的要求，檢測周期也較長，而且還存在交叉感染的危險。但近來研究表明，在HIV感染者的尿液中也可檢查到HIV抗體，這一發(fā)現(xiàn)為艾滋病檢測提供了一個全新的發(fā)展方向，從尿液標本中進行HIV抗體檢測也成為了國際上最新的非侵入性診斷艾滋病毒的新技術(shù)。 中國是一個多民族的國家，HIV/AIDS高發(fā)區(qū)在西部地區(qū)也以少數(shù)民族

3、為主，而且70.6％的HIV感染源由于靜脈毒癮，因此，血液標本的采集是HIV/AIDS防治工作中的一個大的問題。與血液檢查相比，尿液檢查有多種優(yōu)點：尿液中一般不存在HIV病毒、采集時不會引起皮膚損傷。所以尿液HIV—1抗體檢查是一種相對安全而便捷的檢測方法。尿液檢測HIV/AIDS工作的開展，做到了無損傷檢測，很好地解決了這一問題，使HIV篩查工作有了更好的措施，對于早期發(fā)現(xiàn)HIV感染者具有良好的社會和經(jīng)濟價值。 本研究力求建立

4、一種快速、簡易的用于檢測人尿液中抗HIV—1抗體的膠體金免疫層析試紙條，便于早期HIV的大范圍篩查。同時本研究研制HIV—1的gp41基因重組抗原，為生產(chǎn)抗HIV抗體診斷試劑提供優(yōu)質(zhì)抗原。 方法： 一．膠體金免疫層析試紙條的研制 采用檸檬酸三鈉還原法制備直徑為20nm的膠體金顆粒，測定膠體金與標記用gp41抗原的最適用量之比；標記HIV—1 gp—41抗原，將標記物噴于預先處理過的玻璃纖維上。將包被用抗原劃點固定

5、于硝酸纖維素膜上，用于抗HIV—1抗體的捕捉，同時將包被用抗HIV—1 gp41的鼠源性單克隆抗體劃點固定于硝酸纖維素膜上；按常規(guī)組裝成免疫層析檢測試條。 二．pET28a—gp41重組質(zhì)粒的構(gòu)建 通過RT-PCR擴增合成目的片段，然后用限制性內(nèi)切酶將其與原核表達載體pET—28a定向連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a菌中，挑陽性克隆，雙酶切鑒定產(chǎn)物，并進一步進行序列測定。 結(jié)果： 一．HIV—1

6、gp41抗體的檢測 陽性HIV患者尿液中的抗HIV抗體與測試條上金標記物結(jié)合后沿著硝酸纖維素膜移動，與膜上的固相抗原結(jié)合形成肉眼可見的紅色圓點。 二．HIV—1跨膜蛋白gp—41載體的構(gòu)建 重組結(jié)果經(jīng)酶切鑒定，證實構(gòu)建成功。經(jīng)測序進一步證明插入基因正確 結(jié)論： 1.本研究所研制的膠體金免疫層析試紙條臨床應用方便、安全、經(jīng)濟，在HIV早期大范圍篩查中具備很大的市場價值。 2.已成功構(gòu)建了HI