分子生物學(xué)實驗常用工具酶總結(jié)

1、現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗手冊現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗手冊工具酶工具酶基因工程：在人工可以控制條件下，將基因剪切或重新組合，再導(dǎo)入另一生物體內(nèi)，使這些基因在其中表達并遺傳下去的一門技術(shù)。核心：對基因進行人工切割、連接和重新組合，構(gòu)建重組DNA。工具酶：在基因工程的重組DNA過程中，所需要用到的酶的統(tǒng)稱。一、限制性內(nèi)切酶（限制性內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）主要功能：對外源性的雙鏈DNA進行切割、水解，不允許外源性DNA存在于

2、細菌自身細胞內(nèi)。（這種酶能對在自身細胞內(nèi)存在的DNA種類給予限制——限制性內(nèi)切酶）限制修飾系統(tǒng)：合成限制性內(nèi)切酶的細胞，其自身的DNA不受酶的切割，這是因為細菌細胞還會合成一種修飾酶，可以對自身DNA進行修飾，即改變DNA原來具有的可以被限制性內(nèi)切酶識別的核酸順序結(jié)構(gòu)，從而不被限制性內(nèi)切酶識別及切割、水解。保護自身遺傳物質(zhì)穩(wěn)定的機制。限制性內(nèi)切酶：從原核生物中發(fā)現(xiàn)的，約600種，可識別108種不同的特定DNA順序。以內(nèi)切方式水解核酸鏈中

3、的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生DNA片段的5’端為P，3’端為OH。命名：獲得該酶的細菌屬名的第一個字母（大寫）該菌種名的前兩個字母(小寫)株系的字母（小寫）或數(shù)字羅馬數(shù)字（同一株菌種不同內(nèi)切酶的編號）例：細菌屬名細菌種名菌株名稱限制酶名稱ArthrobacterluteusAluIEscherichiacoliRY13EcIBacillusamyloliquefaciensHHamHIHaemophilusinfluenzaeRdHindIII（

4、一）三種常用內(nèi)切酶（一）三種常用內(nèi)切酶1.I型限制性內(nèi)切酶型限制性內(nèi)切酶同時兼有切割DNA的功能和修飾酶的修飾功能。在酶的識別位點上，若DNA兩條鏈菌沒有發(fā)生甲基化，則行使內(nèi)切酶的功能，對DNA進行切割，同時轉(zhuǎn)變成ATP酶。若DNA雙鏈中有一條鏈已發(fā)生甲基化，則此類酶顯示修飾酶的作用，對另一條DNA進行甲基化修飾，然后在行切割功能。（實際上，有內(nèi)切酶、修飾酶、ATP酶及解旋酶四種功能）I型限制性內(nèi)切酶在DNA鏈上的識別位點和切割位點不一

5、致，也不固定。沒有時間應(yīng)用價值?！綝NA甲基化：DNA化學(xué)修飾的一種形式，能在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)（外遺傳機制）。多發(fā)生于CpG二核苷序列上（在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA的CG兩個核苷酸中的胞嘧啶被選擇性添加甲基，形成5甲基胞嘧啶）。甲基化位點可隨DNA的復(fù)制而遺傳（DNA復(fù)制后，甲基化酶用選擇專一性不同而產(chǎn)生相同黏性末端的兩種酶切割兩條不同的DNA片段，可使重組后的DNA片段不再被原來的酶所切割。如：SalI酶切割后

6、產(chǎn)生的黏性末端，XhoI酶切割后產(chǎn)生的黏性末端，兩者經(jīng)連接酶連接產(chǎn)生的序列，既不被SalI酶切割，也不被XhoI酶切割。②在同一位置上切割DNA雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。如：（二）其他類型內(nèi)切酶（二）其他類型內(nèi)切酶1.同工酶（Boschizomer）：來源不同的兩種II型內(nèi)切酶，它們識別核苷酸順序及切割位點都相同，差別只在于當(dāng)識別核苷酸序列中有甲基化的核苷酸時，一種內(nèi)切酶可以切割，而另一種不能。如：HpaII和MspI識別順序都是5’CCGG

7、3’，若其中有5甲基胞嘧啶，則只有Msp酶可切割（GGmCC）。2.Subset酶：識別順序及切割位點相互有關(guān)的酶，互稱Subset酶。如：SamI酶所識別的6個核苷酸順序中含有HpaII酶識別的4個核苷酸順序。所以這兩個酶可以相互代替使用，它們所切割的DNA片段可以相互連接。3.可變酶（特殊的）：識別核苷酸順序一般都大于6個，但其中一個或幾個核苷酸時可以變化的。4.遠距離切割酶：識別核苷酸順序的位置與切割的位點不一致，一般切割位點與指

8、標核苷酸順序的位置之間有10個左右核苷酸的距離。與I型內(nèi)切酶相似，不過I型內(nèi)切酶識別位點與切割位點的距離更遠一些。（三）甲基化酶（不屬于內(nèi)切酶）（三）甲基化酶（不屬于內(nèi)切酶）使識別順序中的某個核苷酸發(fā)生甲基化，保護DNA不被限制性內(nèi)切酶切開。M5C（5甲基胞嘧啶）大多數(shù)以M5CpG的形式存在，即CpG島中的C最容易是甲基化的底物，而甲基化又與受之調(diào)控的基因的表達程度有關(guān)。因此，研究CpG島的甲基化是研究基因調(diào)控的一個重要方向。當(dāng)甲基化酶