rna提取細(xì)節(jié)

1、RNA提取提取RNA提取前的準(zhǔn)備提取前的準(zhǔn)備RNA制備的關(guān)鍵是要抑制細(xì)胞中的RNA分解和防止所用器具及試劑中的RNA分解酶的污染。因此，在實(shí)驗(yàn)中必須采取以下措施：戴一次性手套，使用RNA操作專用實(shí)驗(yàn)臺(tái)，在操作過程中避免講話等。通過以上辦法可以防止實(shí)驗(yàn)者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。使用器具使用器具盡量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，應(yīng)在使用前按下列方法進(jìn)行處理：（1）用0.1%DEPC水溶液在37℃下處理12小時(shí)，（2）然后在1

2、20℃下高溫滅菌30min以除去殘留的DEPC，RNA實(shí)驗(yàn)用的器具建議專門使用，不要用于其他實(shí)驗(yàn)。試劑配制試劑配制用于RNA實(shí)驗(yàn)的試劑，須使用干熱滅菌（180℃，60min）或使用上述方法進(jìn)行DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝（也可以使用RNA實(shí)驗(yàn)用的一次性塑料容器），使用的無菌水需用0.1%的DEPC處理后再進(jìn)行高溫高壓滅菌。RNA實(shí)驗(yàn)用的試劑和無菌水都應(yīng)專用，避免混用后交叉污染。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作在研磨樣品前，先把所要用到的試劑和槍頭

3、、研缽（未拆開報(bào)紙）放在超凈工作臺(tái)上，在研磨樣品前，先把所要用到的試劑和槍頭、研缽（未拆開報(bào)紙）放在超凈工作臺(tái)上，打開紫外燈照射打開紫外燈照射2030min殺菌。殺菌。1.50100mg的普通組織樣品：的普通組織樣品：RNAisoPlus1ml2.試驗(yàn)樣品的研磨和勻漿試驗(yàn)樣品的研磨和勻漿動(dòng)物組織和植物組織材料樣品（1）將超低溫凍結(jié)的RNA提取樣品稱量后迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研缽研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀（無明

4、顯的課件顆粒，如果沒有研磨徹底會(huì)影響RNA的收率和質(zhì)量）。（研磨好的樣品立即加入RNAisoPlus）（2）對(duì)于普通的RNA提取樣品，可以向研缽中加入適量的RNAisoPlus，將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋，然后室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。（3）將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜置5min。（4）12000g4℃離心5min。（5）小心吸取上清液，移入新的離心管中（切勿吸取沉淀）。3.TotalRNA的提取

5、的提?。尤耄尤隦NAisoPlus后，靜置后，靜置5min，離心轉(zhuǎn)移上清，避免未破碎的雜蛋白污染），離心轉(zhuǎn)移上清，避免未破碎的雜蛋白污染）（1）向上述步驟2的勻漿裂解液中加入氯仿（RNAisoPlus的15體積量），蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15s（氯仿沸點(diǎn)低，易揮發(fā)，振蕩時(shí)應(yīng)小心離心管突然彈開）。待溶液充分乳化（無分相現(xiàn)象）后，再室溫靜置5min。（2）12000g4℃離心15min。（3）從離心機(jī)中小心取出離心管，此時(shí)勻漿液分為

6、三層：無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶顏色的下層有機(jī)相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中（切忌吸出白色中間層）。（4）向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在1530℃下靜置10min。DntpMixture(10mMeach)2ulPrimerF0.5ulPrimerR0.5ulTakaRaEXTaqTMHS(5Sul)0.5ul上述的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液≤5ulRnaseFreeDh2OUpto50ul（上下游引物以配制在

7、一起，一個(gè)樣吸取1ul即可，根據(jù)樣品個(gè)數(shù)配制相應(yīng)的大體系）（2）反應(yīng)條件94℃1min94℃30sec55℃30sec30Cycles72℃1minSBE1、SBE3引物使用Primerprimer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)。SBE1引物序列:上游引物5’CAGCCTGCTTCACCTACC3’，下游引物5’GCTCCAGTTGTTGCCTTC3’.SBE3引物序列：上游引物5’ATGCTAGAGTTTGACCGC3’下游引物5’AGTGT

8、GATGGATCCTGCC3’其中，SBE1的退火溫度是55.8，SBE3的退火溫度是60.以Actingene為內(nèi)標(biāo)，調(diào)節(jié)樣品RNA濃度一致，點(diǎn)樣跑電泳，得出電泳圖。PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)1.5%PCR電泳膠的制備：1.5g瓊脂糖，100ml1TAE溶液，微波爐中加熱至完全溶解，冷卻到60℃左右，加入5ulGoldview，搖勻。倒板，冷卻成型即可點(diǎn)樣。點(diǎn)樣及電泳：1ul6LoadingBuffer和5ulPCR產(chǎn)物，混勻后點(diǎn)入凝膠孔中