rna提取方法及原理

1、真核細(xì)胞RNA提取方法及原理 ---Trizol試劑盒抽提法,邱逸敏 12級生物技術(shù),,一、研究背景二、方法及原理,1、研究背景,1.1 RNA研究的重要性 DNA，RNA和蛋白質(zhì)是三種重要的生物大分子，是生命現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)。 DNA的遺傳信息決定生命的主要性狀，而mRNA在信息傳遞中起很重要的作用。其它兩大類RNA，rRNA和tRNA，同樣在蛋白質(zhì)的生物合成中發(fā)揮不可替代的重要功

2、能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遺傳信息由DNA傳遞到表現(xiàn)生命性狀的蛋白質(zhì)的過程中舉足輕重。,2、方法及原理,2.1 RNA的提取流程 1、樣本前處理 2、細(xì)胞裂解 3、 RNA的純化及獲得,RNA提取流程－－ 樣品前處理注意點,,選擇新鮮血液，不得超過4小時,選擇新鮮的幼嫩組織,選擇處于生長旺盛的時期收集細(xì)胞,選擇新鮮組織，生長旺盛的組織,,,可將新鮮血液先進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，得到的白細(xì)胞然后

3、加入一定量的TRNzol，-70℃保存較長時間,去掉培養(yǎng)基，加入一定量TRNzol-70 ℃保存較長時間,使用專門的RNA樣品儲存液進(jìn)行儲存,液氮或加入RNase抑制劑中保存，避免反復(fù)凍融,RNA提取流程－－ 樣品前處理中如何保存樣本,RNA提取流程－－細(xì)胞裂解，以釋放RNA,異硫氰酸胍/酚－TRNzol總RNA提取試劑,獨特配方--RNAplant植物RNA提取試劑,胍鹽/β-巰基乙醇—RNAprep系列RNA提取試劑盒,,RN

4、A提取流程－－ RNA的純化及獲得,,RNA純化要求,1 純化后不應(yīng)存在對酶(如逆轉(zhuǎn)錄酶)有抑制作用物質(zhì)2 排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染3 蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子等的污染降低到最低程度4 排除DNA分子的污染,2.2 RNA提取的注意事項2.2.1 杜絕外源酶的污染一：嚴(yán)格戴好口罩，手套。 二：實驗所涉及的離心管，Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實驗臺面等要徹底處理。 三：實驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNa

5、se-Free。,,2.2.2 阻止內(nèi)源酶的活性 一：選擇合適的勻漿方法。 二：選擇合適的裂解液。 三：控制好樣品的起始量。,,2.2.3 明確自己的抽提目的 一：任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時，抽提成功率急劇下降。 二：RNA 抽提成功的唯一經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實驗的一次成功，而不是得率。,,2.3 Rnase 污染的10大來源 1：手指頭 2：槍頭 3：水/緩沖液 4：實驗臺面 5：內(nèi)源 Rnas

6、e 6：RNA 樣品7：質(zhì)粒抽提 8：RNA 保存 9：陽離子 (Ca, Mg) 10：后續(xù)實驗所用的酶,2.4 幾種RNA提取方法2.4.1 TRIzol法 TRIZOL試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和

7、蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA對于樣品間標(biāo)準(zhǔn)化RNA的產(chǎn)量十分有用。,細(xì)胞,,實驗流程圖,,細(xì)胞選擇,貼壁細(xì)胞 懸浮細(xì)胞,選擇新鮮的幼嫩組織,TRIzol法提取流程 1 ．取新鮮葉片，液氮研磨，每100mg加入 1ml Trizol 充分勻漿，室溫靜置５-10 min 。 2 ．加入 0.2ml 氯仿，振蕩 15s ，靜置 3min 。 3 ．

8、 4 ℃ 離心， 12000rpm × 12min ，取上清。 4 ．加入 0.5ml 異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置 15-20min 。 5 ． 4 ℃ 離心， 12000rpm × 10min ，棄上清。 6 ．加入 1ml 75% 乙醇，輕輕洗滌沉淀。 4 ℃ ， 12000 rpm× 3min ，棄上清。 7.  室溫晾干，加入30-50ul的 DEPC H