利用實時定量pcr和ct法分析基因相對表達量

1、利用實時定量利用實時定量PCRPCR和2－△△CT△△CT法分析基因相對表達量法分析基因相對表達量METHODS25402–408(2001)AnalysisAnalysisofofRelativeRelativeGeneGeneExpressionExpressionDataDataUsingUsingRealTimeRealTimeQuantitativeQuantitativePCRPCRthethe2－△△CT△△CTMetho

2、dMethodKenhJ.LivakThomasD.Schmittgen1AppliedBiosystemsFosterCityCalifnia94404DepartmentofPharmaceuticalSciencesCollegeofPharmacyWashingtonStateUniversityPullmanWashington991646534摘要：摘要：現(xiàn)在最常用的兩種分析實時定量PCR實驗數(shù)據(jù)的方法是絕對定量和相對定量。

3、絕對定量通過標準曲線計算起始模板的拷貝數(shù)；相對定量方法則是比較經(jīng)過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標轉(zhuǎn)錄本之間的表達差異。2－△△CT方法是實時定量PCR實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法，即相對定量的一種簡便方法。本文介紹了該方法的推導，假設(shè)及其應用。另外，在本文中我們還介紹了兩種2－△△CT衍生方法的推導和應用，它們在實時定量PCR數(shù)據(jù)分析中可能會被用到。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：反轉(zhuǎn)錄PCR定量PCR相對定量實時PCRTaqman反轉(zhuǎn)錄P

4、CR（RTPCR）是基因表達定量非常有用的一種方法（13）。實時PCR技術(shù)和RTPCR的結(jié)合產(chǎn)生了反轉(zhuǎn)錄定量PCR技術(shù)（45）。實時定量PCR的數(shù)據(jù)分析方法有兩種：絕對定量和相對定量。絕對定量一般通過定量標準曲線來確定我們所感興趣的轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)；相對定量方法則是用來確定經(jīng)過不同處理的樣品目標轉(zhuǎn)錄本之間的表達差異或是目標轉(zhuǎn)錄本在不同時相的表達差異。絕對定量通常在需要確定轉(zhuǎn)錄本絕對拷貝數(shù)的條件下使用。通過實時PCR進行絕對定量已有多篇報道

5、（69），包括已發(fā)表的兩篇研究論文（1011）。在有些情況下，并不需要對轉(zhuǎn)錄本進行絕對定量，只需要給出相對基因表達差異即可。顯然，我們說X基因在經(jīng)過某種處理後表達量增加2.5倍比說該基因的表達從1000拷貝細胞增加到2500拷貝細胞更加直觀。用實時PCR對基因表達進行相對定量分析需要特殊的公式、假設(shè)以及對這些假設(shè)的驗證。2－△△CT方法可用于定量PCR實驗來計算基因表達的相對變化：2－△△CT公式的推導，以及實驗設(shè)計，有效性評估在App

6、liedBiosystemsUserXN代表經(jīng)過均一化處理過的初始目標分子量；△CT表示目標基因和內(nèi)標基因CT值的差異（CTX－CTR）整理上式得：最后用任一樣本q的XN除以參照因子（calibratcb）的XN得到：在這里對于一個少于150bp的擴增片斷而言，如果Mg2濃度、引物都進行了適當?shù)膬?yōu)化，擴增效率接近于1。因此目標序列的量通過內(nèi)均一化處理之后相對于參照因子而言就是1.2.1.2.2－△△CT△△CT方法的假設(shè)和應用方法的假設(shè)