關(guān)于細胞復蘇

1、關(guān)于細胞復蘇關(guān)于細胞復蘇細胞冷胞冷凍保存與復保存與復蘇原理原理三木三木轉(zhuǎn)自體外培養(yǎng)的原理和技術(shù).薛慶善主編.2001年2月.科學出版社pp128136細胞冷凍保存與復蘇原理細胞冷凍保存與復蘇原理在低于700C的超低溫條件下，有機體細胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。因此，采取適當?shù)姆椒▽⑸锊牧辖抵脸蜏?，即可使生命活動固定在某一階段而不衰老死亡。當以適當?shù)姆椒▽龃娴纳锊牧匣謴椭脸貢r，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復正常。所謂冷凍保存，就

2、是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于700C的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。而復蘇就是以一定的復溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復到常溫的過程。不論是微生物、動物細胞、植物細胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進行凍存，并在適當條件下復蘇。水在低于零度的條件下會結(jié)冰。如果將細胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細胞內(nèi)外的水分都會結(jié)冰，所形成的冰晶會造成細胞

3、膜和細胞器的破壞而引起細胞死亡。這種因細胞內(nèi)部結(jié)冰而導致的細胞損傷稱為細胞內(nèi)冰晶的損傷。如果將細胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細胞外部的水分會首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時間過長，細胞膜上脂質(zhì)分子會受到損壞，細胞便發(fā)生滲漏，在復溫時，大量水分會因此進入細胞內(nèi)，造成細胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導致的細胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷。當溫度進一步下降，細胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生

4、冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護劑，則可保護細胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因為冷凍保護劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細胞免受溶質(zhì)損傷，細胞得以在超低溫條件下保存。在復蘇時，一般以很快的速度升溫，12分鐘內(nèi)即恢復到常溫，細胞內(nèi)外不會重新形成較大的冰晶，也不會暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過長的時間，從而無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細胞經(jīng)復蘇后仍保持其正常的結(jié)

5、構(gòu)和功能。冷凍保護劑對細胞的冷凍保護效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復溫速率有關(guān)。而且不同的冷凍保護劑其冷凍保護效果也不一樣。冷凍速率冷凍速率冷凍速率是指降溫的速度，直接關(guān)系到冷凍效果。細胞在冷凍過程中會發(fā)生如下變化：當細胞被冷至50C時，因溶液中加有冷凍保護劑而降低溶液的冰點，細胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；當被冷至5～150C之間時，細胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會比細胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學能

6、。其結(jié)果是，細胞內(nèi)水分子為了和細胞外水分子保持化學能的平衡，會向細胞外流動。冷凍速度不同，細胞內(nèi)水分向外流動的情況也不相同：如果冷凍速度慢，細胞內(nèi)水分外滲多，細胞脫水，體積縮小，細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細胞內(nèi)不會發(fā)生結(jié)冰；如果冷凍速度快，細胞內(nèi)水分沒有足夠的時間外滲，結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細胞內(nèi)結(jié)冰；如果冷凍速度非?？欤闯焖倮鋬觯?，則細胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀態(tài)（玻璃化冷凍）。Luyet（1973）證實液體的凝固可分為兩

7、種形式：一種是晶體化，溶液中的分子呈有序排列；另一種情況是非晶體即玻璃化，液體中的分子呈無序狀態(tài)，保持未凝固前的狀態(tài)。不同的冷凍速度既然能使細胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化，也可以對細胞產(chǎn)生不同的損傷。當冷凍速度過慢時，細胞脫水嚴重，細胞體積嚴重收縮，超過一定程度時即失去活性。同時冷凍速度過慢，還會引起細胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。當冷凍速度過快時，細胞內(nèi)水分來不及外滲，會形成較到冰晶，造成細胞膜及細

8、胞器的破壞，產(chǎn)生細胞內(nèi)冰晶損傷。超快速玻璃化冷凍對細胞存活來說是最為理想的冷凍方法。細胞內(nèi)外呈玻璃化凝固，無冰晶形成或形成很小的冰晶，對細胞膜后應(yīng)及時洗滌冷凍保護劑。冷凍保存方法冷凍保存方法按照冷凍保護液在凍結(jié)后是否形成冰晶來劃分，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種。非玻璃化凍存是利用各種溫級的冰箱分階段降溫至700C～800C，然后直接投入液氮進行保存；或者是利用電子計算機程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至

9、1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。以該種方法凍結(jié)的細胞懸液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化凍存則是指利用多種高濃度的冷凍保護劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護液保護懸浮細胞，直接投入液氮進行凍存的方法。以該中方法凍結(jié)的細胞懸液沒有冰晶的形成。但目前細胞凍存最常用的仍是前一種方法。非玻璃化凍存方法非玻璃化凍存方法下面以腫瘤細胞和雜交瘤細胞為例，介紹非玻璃化凍存細胞的詳細過程。主要材料主要材料（1）儀器設(shè)備：普通冰箱、300C低溫冰箱和700

10、C～800C超低溫冰箱、液氮凍存罐、高速離心機、電子計算機程控降溫儀等；（2）凍存管：容量為1ml或1.5ml；（3）冷凍保護液：一般是以9份小牛血清或細胞培養(yǎng)液與1份DMSO混合而成?，F(xiàn)配現(xiàn)用，或配制后防入普通冰箱冰盒內(nèi)冷凍保存。使用前，于室溫下水浴溶解；（4）待凍存細胞：各種腫瘤細胞或雜交瘤細胞。操作過程操作過程1.待凍存細胞懸液的制備(1)按常規(guī)方法消化處于對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)物，制備單細胞懸液，并計算細胞總數(shù)；(2)將細胞懸液以

11、800～1000rmin離心5min，去上清夜；(3)向細胞沉淀物中加入冷凍保護液，輕輕吹打混勻，使細胞密度達1106～1107個ml；(4)按每管1～1.5ml的量分裝于凍存管內(nèi)，擰緊管蓋；(5)再凍存管上做好標記，包括細胞代號及凍存日期。2.分級冷凍(1)先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），約40min；(2)接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室（100C～200C），約30～60min；(3)將凍存管轉(zhuǎn)入低溫冰箱（300C），放

12、置30min左右；(4)然后將凍存管轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱（700C～800C），過夜；(5)最后將凍存管投入液氮保存。3.記錄做好凍存記錄。記錄內(nèi)容包括凍存日期、細胞代號、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。凍存結(jié)果凍存結(jié)果如此凍存的細胞，其存活率可達90%以上。討論討論在使用DMSO前，不要對其進行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。高壓滅菌反而會破壞其分子結(jié)構(gòu)，以致降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有毒，故在配制時