分離提純

1、,第四章 植物病毒分離與提純,基本原理,病毒的分離,病毒的毒源繁殖,病毒的提純,病毒的分離提純的實例,,一、病毒分離提純的基本原理,生物分離.依據(jù)病毒的分離寄主、傳毒介體或病毒物理特性等的差異，將一種病毒或株系同其他病毒或株系分離開來 .,1.分離原理,,理化提純.根據(jù)病毒與寄主細(xì)胞組分的理化特性差異，應(yīng)用各種理化方法，去除寄主組織和細(xì)胞中的其他非病毒組分，提取出具有侵染力的濃縮的高純度病毒。,2.提純原理,,二、病毒的分離,田間采

2、集的自然感染病毒的標(biāo)本，常混雜幾種病毒或病毒的不同株系。福建漳州水仙: 水仙花葉病毒(Narcissus mosaic virus, NMV)、 水仙黃條病毒(Narcissus yellow stripe virus, NYSV) 水仙潛隱病毒(Narcissus latent virus, NLV) 鑒于自然感染病株的病原的復(fù)雜性，往往需要通過生物分離方法，從自然感染病株中，獲

3、得所需的單一病毒或株系，以保證研究結(jié)果的科學(xué)性。,,（一）、病毒分離的方法主要有以下幾種：分離寄主來分離病毒或株系 ?；轶w分離病毒或株系 病毒的物理特性來分離病毒 病毒的穩(wěn)定性，對酶的耐受性、病毒的沉降系數(shù)等差異來分離不同病毒。,,1.利用分離寄主來分離病毒或株系 枯斑寄主 :有些病毒侵染寄主植物后，會誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生過敏反應(yīng)，出現(xiàn)局部枯斑而不擴展成系統(tǒng)侵染。如煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)

4、和黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)在普通煙上都產(chǎn)生系統(tǒng)花葉，但TMV在心葉煙上產(chǎn)生枯斑，CMV在心葉煙上則還是系統(tǒng)花葉，這樣我們就可以用心葉煙來分離TMV。 對有些病毒來說，還沒有發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生枯斑癥狀的寄主，可以根據(jù)病毒的寄主范圍的差異，也就是利用寄主的專化性來分離病毒。如CMV在黃瓜上產(chǎn)生系統(tǒng)花葉癥狀，而黃瓜對TMV免疫，這樣，就可以利用黃瓜將CMV從上述兩種病毒混合侵染的病株中分離出來。,,

5、對同一病毒的不同株系，也可以用一套鑒別寄主加以區(qū)別，并把所需的病毒株系分離出來 .鑒別寄主 指用來鑒別某一病毒或其株系的具有特定反應(yīng)的植物。凡是病毒侵染后能產(chǎn)生快而穩(wěn)定、并具有特征性癥狀的植物都可作為鑒別寄主。,,鑒別寄主譜：組合使用幾種或一套鑒別寄主稱為鑒別寄主譜。鑒別寄主譜中一般包括可系統(tǒng)侵染的寄主、局部侵染的寄主和不受侵染的寄主。,,2.利用?；轶w分離病毒或株系 病毒的介體傳染有較強的?；裕匆环N病毒或株

6、系往往只能由一種或幾種介體傳播， 水稻簇矮病毒(RBSV)----黑尾葉蟬(Nephotettix cincticeps) 水稻矮縮病毒(RDV)----電光葉蟬(Recilia dorsalis) 水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)----灰飛虱(Laodelphax striatellus) 水稻齒矮病毒(RRSV)----褐飛虱(Nilaparvata lugens),,3.利用病毒的物理特性來分離病毒 鈍化溫度（TIP）;

7、稀釋限點（DEP）;體外存活期（LIV）等,,稀釋限點(Dilution End Point，DEP) 保持病毒侵染力的最高稀釋度,用10-1,10-2,10-3……表示，它反映了病毒的體外穩(wěn)定性和侵染能力，也象征著病毒濃度的高低。,,鈍化溫度(Thermal Inactivation Point,TIP) 處理十分鐘使病毒喪失活性的最低溫,用攝氏溫度表示。TIP最低的病毒是番茄斑萎病毒，只有有45℃；最高的是煙草花葉病毒，

8、為97℃；而大多數(shù)植物病毒在55—70℃之間；,,體外存活期(Longevity in vitro，LIV) 在室溫(20-22℃)下，病毒抽提液保持浸染力的最長時間。大多數(shù)病毒的存活期在數(shù)天到數(shù)月。,,三、病毒的毒源繁殖,病毒的繁殖寄主一般必須具備以下條件： （1）能產(chǎn)生較高濃度的病毒(繁殖寄主中的病毒濃度是個重要的衡量指標(biāo)) ；（2）不含有大量的抑制病毒或不可逆的沉淀病毒的物質(zhì)，如酚類化合物、有機酸、粘液和膠質(zhì)等；（3）

9、各種寄主成分的大小和物理性質(zhì)與病毒粒體顯著不同，不影響病毒的分離和提純，也不吸附在病毒粒體表面；（4）易于培養(yǎng)，生長迅速；（5）在溫室條件下不感染其他病害，對殺蟲劑等不敏感；（6）系統(tǒng)發(fā)病；（7）病毒易接種與感染。,尋找合適的繁殖寄主來擴大病毒繁殖，這是成功提純病毒的關(guān)鍵因素之一,,煙草、番茄、黃瓜、豇豆、莧色藜、南瓜和矮牽牛,最常用的繁殖寄主:,木本植物，由于葉片含有較多的單寧物質(zhì)，往往難以提純病毒，所以一般接種在黃瓜、莧色藜

10、等寄主上繁殖后提純。 大部分水稻病毒的繁殖寄主就是水稻本身，但不同品種的病株中的病毒濃度相差很大。例如：馬鈴薯X病毒在番茄植株上的繁殖比馬鈴薯和煙草上的繁殖的產(chǎn)量高。馬鈴薯黃矮病毒在黃花煙上繁殖比在普通煙上的產(chǎn)量大。,,溫度對病毒濃度的影響：高產(chǎn)株系：不同株系在植株積累的病毒濃度往往不同。同一病毒不同株系在繁殖寄主上的濃度有時相差甚遠(yuǎn)，同時也要注意所用株系的侵染力和穩(wěn)定性。病葉的采收：病毒接種植物后，隨著復(fù)制其濃度逐漸增

11、高，約在幾天或幾周后達到最高峰，多數(shù)病毒其濃度迅速下降，必須及時采收病葉以便獲得較高的濃度。,,四、病毒的提純,獲得盡可能多的具有生物活性的病毒粒體，并不含有寄主成分。,病毒提純目的,病毒的提純能否成功？,內(nèi)在因素：病毒在植物體內(nèi)的濃度、病毒形態(tài)和大小、株系、穩(wěn)定性等。外在因素：緩沖液濃度及pH值、澄清劑、離心力和密度梯度離心方式的選擇等。,不同的病毒，甚至同一病毒不同株系，特性不同，因此需要不同的提純步驟。,,病毒基本保持侵染活性

12、借鑒提純蛋白質(zhì)的一些技術(shù)方法同一病毒粒體的大小、形狀、沉降系數(shù)和密度高度一致，可以利用差速離心和密度梯度離心的技術(shù)來提純病毒,病毒提純程序設(shè)計的主要依據(jù),病毒的提純步驟,植物細(xì)胞破碎:緩沖液 ;還原劑 ;去構(gòu)劑 ;乙二胺四乙酸（EDTA） 提取液的澄清 :澄清劑有氯仿、正丁醇、四氯化碳、乙醇等 病毒濃縮 :聚乙二醇（PEG）沉淀法 病毒精提純 :差速離心法和密度梯度離心法。,,病毒的提純步驟,植物細(xì)胞破碎:緩沖液 ;還原劑 ;

13、去構(gòu)劑 ;乙二胺四乙酸（EDTA） 將植物細(xì)胞破碎目的是使其中的病毒釋放出來。 使病毒處于穩(wěn)定、溶解和不聚合狀態(tài)。常采用組織搗碎機或勻漿機進行，通過其中的刀片高速運轉(zhuǎn)，剪切植物組織和破碎細(xì)胞。液氮來粉碎細(xì)胞, 以利病毒釋放。緩沖液:1-3倍體積，pH7左右，磷酸、硼酸和檸檬酸等,0.1-0.5M附加成分：還原劑（亞硫酸鈉、巰基乙醇、抗壞血酸等抑制酚類氧化酶的活性。）,,病毒的提純步驟,植物細(xì)胞破碎:緩沖液 ;還原劑 ;去構(gòu)劑

14、 ;乙二胺四乙酸（EDTA） 病毒粒體的聚合是提純中的重要問題之一。去構(gòu)劑:TritonX-100、吐溫-20，0.5-1moL/L 尿素。目的分散病毒粒體。乙二胺四乙酸（EDTA）：破壞核糖體，阻止其與病毒共同沉降下來，同時還能抑制需要二價金屬離子的酶的活性。,,病毒的提純步驟,提取液的澄清 :澄清劑有氯仿、正丁醇、四氯化碳、乙醇等 目的：盡可能使病毒粒體和細(xì)胞組分分開.大分子細(xì)胞器（葉綠體、線粒體、細(xì)胞核等）通過低速離

15、心方法除去。小分子物質(zhì)（糖、鹽和氨基酸等）可溶物質(zhì)介乎中間的蛋白質(zhì)、核糖體、微粒體最難去除，可采用澄清劑處理。,,病毒的提純步驟,澄清劑有氯仿、正丁醇、四氯化碳、乙醇等氯仿：線狀病毒正丁醇和四氯化碳：球狀病毒澄清劑可使一些蛋白質(zhì)變性，除去葉綠素和脂類物質(zhì)等。在提取液中加入鎂皂土可以結(jié)合核糖體和RNase，加熱或冰凍可以使寄主蛋白凝聚。,,病毒濃縮 :在絕大部寄主蛋白和色素去掉以后，病毒濃縮過程可以進一步去除雜質(zhì)。方法：聚

16、乙二醇（PEG)沉淀法。在一定的鹽濃度下，PEG可以使病毒沉淀。（PEG6000）,,病毒精提純 :目的：獲得高純度的病毒制品。差速離心法和密度梯度離心法。密度梯度離心中單一樣品組份的分離是借助于混合樣品穿過密度梯度層的沉降或上浮來達到的;差速離心法是用不同強度的離心力使具有不同質(zhì)量的物質(zhì)分級分離 密度梯度離心只用一個離心轉(zhuǎn)速，而差速離心用兩個甚至更多的轉(zhuǎn)速。 密度梯度離心的物質(zhì)是密度有一定差異的，而差速離心是適用于混合樣品

17、中各沉降系數(shù)差別較大組分,,差速離心法：根據(jù)不同大小和密度的粒體在沉降速度上不同，將分離的樣品交替進行低速和高速（或超速）離心?？梢蕴幚泶罅繕悠?，可作為病毒精提純的第一階段。低速(8000rpm 以下)或中速（10 000-12 000rpm）除去較大的植物組織碎片等雜質(zhì)。高速（20 000rpm)以上或超速（28 000rpm）離心1-2h，使大部分病毒沉淀。離心速度的選擇:根據(jù)病毒形態(tài)和大小而異。,,密度梯度離心在

18、密度梯度介質(zhì)中進行的依密度而分離的離心法。各組分會依其密度分布在與其自身密度相同的液層中。密度梯度可以離心前預(yù)先制備(如疊加不同濃度蔗糖、甘油)或在離心中自然形成(如使用氯化銫時)。可用于分析型或制備型的離心分離。濃度高的病毒，在暗室中用光束從離心管頂部往下照射，可在離心管中看到乳白色的病毒帶，直接用注射針筒吸出病毒帶，再經(jīng)超速離心獲得精提純的病毒。濃度低的病毒，無法形成肉眼可見的病毒帶，就需要分部收集各密度蔗糖溶液，再經(jīng)紫外檢測，

19、確定含病毒部分，再經(jīng)超速離心獲得精提純的病毒。,,病毒分離提純的幾個實例,取300g 人工接種病株, 加900ml 0.01 M的磷酸緩沖液(pH7.2)研磨, 紗布過濾, 4,500g離心30min.,,水稻條紋病毒（RSV）的提純,,上清加20%CHCl3, 在破碎乳化機中乳化1min.(15,000rpm), 4,500g離心30min.,,上清加6%PEG, 1%NaCl, 冰浴攪拌40min., 8,000g, 30min.,

20、,沉淀加20ml 0.01M的磷酸緩沖液(pH7.2)懸浮, 低速離心去沉淀,,,,上清在60,000g下離心70min., 沉淀用3ml 0.01M 磷酸緩沖液再懸浮, 低速離心去沉淀,,上清加到10%-40%的連續(xù)蔗糖密度梯度上, 79,000g, 離心2h.,,離心管中的溶液分成4個部分, 分別取出, 各用磷酸緩沖液稀釋后, 60,000g分裝到各離心管中, 離心70min., 沉淀分別用0.5 ml 0.01M 磷酸緩沖液充分懸

21、浮,.,,,,,80g接種病葉，加入80ml 0.5M Na2HPO4-KH2PO4（pH7.2，含1％巰基乙醇）研磨，紗布過濾，,煙草花葉病毒（TMV）的提純,,加入8%的正丁醇，經(jīng)勻漿乳化，5000g離心25min，取( ? )。,加入4％的PEG和0.2M NaCl，攪拌溶解，靜置1h，5000g離心30min，取( ? )。,用16ml 0.01M PBS（pH7.2）懸浮，4000g離心20min，取(?)。再加入4

22、％的PEG和0.2M NaCl，攪拌溶解，靜置1h，5000g離心30min，取(?)。,,,用1.6 ml 0.01M PBS（pH7.2）懸浮，4000g離心20min，取(?)。25000g離心90min，取(?)，用2ml 0.01M PBS（pH7.2）懸浮，加到10％－40％蔗糖密度梯度離心管頂部，22000g離心2h，吸取乳白色病毒帶，42000g離心90min，取沉淀，用少量0.01M PBS（pH7.2）懸浮，即為病毒