病毒制造

1、病毒制造Virus Manufacturing從負(fù)到正的大變革Huge Transformation from Negative to Positive,主講：張婷,思考：,什么是病毒（生物學(xué)概念）？病毒為何會(huì)得到化學(xué)化工專家的重視？M13噬菌體病毒的結(jié)構(gòu)是如何的？要獲得所需的噬菌體，需要經(jīng)過哪些步驟進(jìn)行改造？M13噬菌體病毒有何應(yīng)用？,1. 病毒制造——從大千世界說起,大千世界——“活”的世界：動(dòng)物、植物、微生物。,1.

2、 病毒制造——從大千世界說起,什么是病毒？（生物學(xué)概念）病毒（Virus）由一種核酸分子（DNA或RNA）與蛋白質(zhì)（Protein）構(gòu)成或僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成。病毒個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單；沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，沒有實(shí)現(xiàn)新陳代謝所必需的基本系統(tǒng)，病毒自身不能復(fù)制。但是當(dāng)它接觸到宿主細(xì)胞時(shí)，便脫去蛋白質(zhì)外套，它的核酸（基因）侵入宿主細(xì)胞內(nèi)，借助后者的復(fù)制系統(tǒng)，按照病毒基因的指令復(fù)制新的病毒。目前，科學(xué)界公認(rèn)的對(duì)病毒的定義是只能在活著的宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的感染

3、源。,①形體極其微小，多數(shù)病毒直徑在100nm(20~200nm），較大的病毒直徑為300－450納米（nm），較小的病毒直徑僅為18-22納米。②沒有細(xì)胞構(gòu)造，其主要成分僅為核酸和蛋白質(zhì)兩種，故又稱“分子生物”；③每一種病毒只含一種核酸，不是DNA就是RNA。④既無產(chǎn)能酶系，也無蛋白質(zhì)和核酸合成酶系，只能利用宿主活細(xì)胞內(nèi)現(xiàn)成代謝系統(tǒng)合成自身的核酸和蛋白質(zhì)成分。⑤以核酸和蛋白質(zhì)等“元件”的裝配實(shí)現(xiàn)其大量繁殖。⑥在離體條件下，能

4、以無生命的生物大分子狀態(tài)存在，并長(zhǎng)期保持其侵染活力。⑦對(duì)一般抗生素不敏感，但對(duì)干擾素敏感。⑧有些病毒的核酸還能整合到宿主的基因組中，并誘發(fā)潛伏性感染。⑨還有些病毒是沒有DNA或RNA的，例如朊病毒，它是亞病毒（類似于病毒），只有蛋白質(zhì)的那一類，它以病毒為寄主。,病毒能增殖、遺傳和演化，因而具有生命最基本的特征。其主要特點(diǎn)：,病毒幾乎能感染所有的細(xì)胞生物并對(duì)其產(chǎn)生病害，如感冒、禽流感、非典型肺炎、肝炎、流行性出血熱、艾滋病……,1.

5、 病毒制造——從大千世界說起,埃博拉病毒,“埃博拉”病毒是人類迄今為止所發(fā)現(xiàn)的死亡率最高的一種病毒，死亡率在50％至90％之間。世界衛(wèi)生組織公布的最新數(shù)字說，自1976年發(fā)現(xiàn)這一病毒以來，全世界的感染者已達(dá)1500多例，其中已有1000多人死亡。 “埃博拉”病毒的形狀宛如 “如意”，極活躍，病毒主要通過體液，如汗液、唾液或血液傳染，甚至握一握手就會(huì)傳染。潛伏期為2周左右。感染者均是突然出現(xiàn)高燒、頭痛、咽喉疼、虛弱和肌肉疼痛。然后是嘔吐

6、、腹痛、腹瀉。發(fā)病后的兩星期內(nèi)，病毒外溢，導(dǎo)致人體內(nèi)外出血、血液凝固、壞死的血液很快傳及全身的各個(gè)器官，病人最終出現(xiàn)口腔、鼻腔和肛門出血等癥狀，患者可在24小時(shí)內(nèi)死亡。,SARS病毒,SARS病毒是冠狀病毒的一個(gè)變種，是引起非典型肺炎的病原體。變種冠狀病毒與流感病毒具有親緣關(guān)系，但它是非常獨(dú)特的一種冠狀病毒，在2002年冬到2003年春肆虐全球的嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS、傳染性非典型肺炎）的元兇就是這種冠狀病毒。2013年，中國(guó)科

7、學(xué)院武漢病毒研究所研究員石正麗帶領(lǐng)的國(guó)際研究團(tuán)隊(duì)分離到一株與SARS病毒高度同源的SARS樣冠狀病毒，進(jìn)一步證實(shí)中華菊頭蝠是SARS病毒的源頭。,人類免疫缺陷病毒,人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus;abbr:HIV），即艾滋?。ˋIDS，獲得性免疫缺陷綜合征）病毒，是造成人類免疫系統(tǒng)缺陷的一種病毒。1981年，人類免疫缺陷病毒在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)。它是一種感染人類免疫系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒（Lentivir

8、us），屬逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。HIV通過破壞人體的T淋巴細(xì)胞，進(jìn)而阻斷細(xì)胞免疫和體液免疫過程，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)癱瘓，從而致使各種疾病在人體內(nèi)蔓延，最終導(dǎo)致艾滋病。由于HIV的變異極其迅速，難以生產(chǎn)特異性疫苗，至今無有效治療方法，對(duì)人類健康造成極大威脅。2015年3月4日，多國(guó)科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，艾滋病毒已知的4種病株，均來自喀麥隆的黑猩猩及大猩猩，是人類首次完全確定艾滋病毒毒株的所有源頭。,病毒的結(jié)構(gòu),2.病毒的輔助結(jié)構(gòu)有些病毒核衣殼外還有

9、一層脂蛋白雙層膜狀結(jié)構(gòu)，是病毒以出芽方式釋放，穿過宿主細(xì)胞膜或核膜時(shí)獲得的，稱之為包膜。在包膜表面有病毒編碼的糖蛋白，鑲嵌成釘狀突起，稱為刺突。有包膜病毒對(duì)有機(jī)溶劑敏感。包膜功能：①保護(hù)核衣殼；②促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞的吸附；③具有抗原性。,1.病毒的基本結(jié)構(gòu)有核心和衣殼，二者形成核衣殼。核心位于病毒體的中心，為核酸，為病毒的復(fù)制、遺傳和變異提供遺傳信息；衣殼是包圍在核酸外面的蛋白質(zhì)外殼。衣殼的功能：①具有抗原性；②保護(hù)核酸；③介導(dǎo)病

10、毒與宿主細(xì)胞結(jié)合。,病毒出現(xiàn)假說：,1．蛋白質(zhì)、核酸遺失說：大生物（此處大生物意思是具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物，區(qū)別于病毒的非細(xì)胞結(jié)構(gòu)生物）由于細(xì)胞脫落和破裂，導(dǎo)致游離的蛋白質(zhì)和DNA、RNA的出現(xiàn)，在某種情況下，這些蛋白質(zhì)由于化學(xué)作用形成了一個(gè)內(nèi)部可容納小分子的結(jié)構(gòu)，里面裹著DNA或者RNA，甚至單獨(dú)的蛋白質(zhì)和單獨(dú)的DNA、RNA游離。2．生命起源說：病毒是最原始的生命體，早在沒有細(xì)胞之前就有病毒存在，那時(shí)的病毒還只限于蛋白質(zhì)和核酸，沒

11、有表現(xiàn)出病毒的寄生特征，當(dāng)細(xì)胞體生物出現(xiàn)之后，個(gè)別這種蛋白質(zhì)和核酸或他們的復(fù)合體表現(xiàn)出寄生性。,病毒在化學(xué)化工中的“魅力”,化學(xué)化工專家利用病毒的超微結(jié)構(gòu)和非凡的自我復(fù)制能力，制造和組裝了使人類從中受益的各種功能結(jié)構(gòu)。利用生物體系實(shí)現(xiàn)化工產(chǎn)品生產(chǎn)的生物化工技術(shù)，是化學(xué)化工的一個(gè)重要方向?！盎睢钡纳矬w，擁有最神奇的化學(xué)分子合成、新物質(zhì)創(chuàng)造的能力。病毒通常為納米級(jí)別，病毒的衣殼蛋白、內(nèi)表面和中間界面都可以進(jìn)行基因工程改造或者化學(xué)修飾。

12、作為納米級(jí)的生物模板，病毒在新型電子材料和電池開發(fā)、化學(xué)工業(yè)催化劑制備、生物傳感器開發(fā)和痕量化學(xué)品檢測(cè)、重大疾病治療等領(lǐng)域?qū)l(fā)揮巨大作用。,2.病毒制造的科學(xué)基礎(chǔ),病毒是目前已知的結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單、“活”的生命單位。有些病毒侵染的對(duì)象是特定的微生物和植物，對(duì)人類安全無害，如絲狀的M13噬菌體、球狀的MS2和T7噬菌體、長(zhǎng)桿狀的煙草花葉病毒、多面體形狀的豇豆花葉病毒等。,為什么要采用納米級(jí)別的“病毒”顆粒作為模板，制造所需的分子機(jī)器或材料以實(shí)

13、現(xiàn)所期望的功能呢？,納米尺度時(shí)，材料的表面結(jié)構(gòu)和電子性質(zhì)會(huì)發(fā)生顯著改變，產(chǎn)生表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、量子隧道效應(yīng)及庫倫阻塞效應(yīng)等新性質(zhì)，從而賦予其不同的特性和功能。如：晶粒尺寸在納米量級(jí)的金屬催化劑有更高的催化活性、選擇性和穩(wěn)定性。生物擁有最神奇的靶標(biāo)定位和檢測(cè)、材料合成、加工和功能實(shí)現(xiàn)的能力。如：抗體蛋白能在成千上萬個(gè)配體分子中尋找到自己特異性識(shí)別的抗原并與之結(jié)合；DNA分子依靠堿基之間特定的互補(bǔ)配對(duì)規(guī)則精確自組裝形成雙螺旋結(jié)構(gòu)；酶

14、分子可以特異并專一性的與特定的底物結(jié)合進(jìn)行高效催化。,抗體-抗原特異性分子識(shí)別,DNA自我復(fù)制時(shí)的堿基結(jié)合,DNA分子精確自組裝,2.病毒制造的科學(xué)基礎(chǔ),病毒制造的實(shí)質(zhì)，就是一種多學(xué)科交叉的生物納米前沿技術(shù)。生物納米技術(shù)的主要研究?jī)?nèi)容：將納米技術(shù)和生物體系的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，借助迅速興起的生物納米技術(shù)，模仿生物系統(tǒng)的能力來轉(zhuǎn)化和傳輸能量、創(chuàng)造生物質(zhì)、合成專用有機(jī)化學(xué)品、實(shí)現(xiàn)特異性識(shí)別和檢測(cè)、發(fā)送和傳導(dǎo)信息、儲(chǔ)存信息、進(jìn)行有序和可控運(yùn)動(dòng)、

15、自組裝和復(fù)制等。簡(jiǎn)單地說，只要改造病毒的基因，就能得到需要的特殊病毒結(jié)構(gòu)，從而具有精心設(shè)計(jì)的新功能。,2.病毒制造的科學(xué)基礎(chǔ),M13噬菌體病毒,野生型M13噬菌體長(zhǎng)800~900nm，直徑6~10nm。它的單鏈環(huán)狀DNA分子有6407個(gè)堿基，編碼噬菌體的11種蛋白，其中，最終成熟的噬菌體顆粒由5種衣殼蛋白（結(jié)構(gòu)蛋白）組成，包括周身包覆的p8衣殼蛋白（pVIII蛋白或g8p）、一個(gè)末端的p3衣殼蛋白（pIII蛋白或g3p）和p6（pVI

16、或g6p）以及另一個(gè)末端的p7（pVII）和p9（pIX）衣殼蛋白。其他6種由其DNA編碼的蛋白僅出現(xiàn)在DNA復(fù)制和噬菌體裝配的過程中。,在M13噬菌體的5種衣殼蛋白中，末端p3蛋白和周身p8蛋白最早、最廣泛地被用于基因改造和各種新功能的實(shí)現(xiàn)。,成熟的p8蛋白是含有50個(gè)氨基酸殘基的螺旋蛋白，大約有2700個(gè)拷貝，呈五倍螺旋對(duì)稱重復(fù)排列，形成噬菌體的柔性圓柱體衣殼的主要部分，將單鏈環(huán)狀的基因組DNA包裹于其內(nèi)部。P3蛋白是5個(gè)拷貝的次

17、要衣殼蛋白，它通過p6蛋白附著在噬菌體顆粒上，是噬菌體吸附宿主細(xì)胞所必需的。,蛋白的結(jié)構(gòu)由它的單鏈DNA基因決定。通過剪切、插入和連接新設(shè)計(jì)的基因序列到p3或p8等基因的上游，擴(kuò)增后的新M13噬菌體就可以在相應(yīng)衣殼蛋白的末端展示出新的精細(xì)結(jié)構(gòu)，并具有相應(yīng)的新功能，如特異性地吸附不同的金屬離子。,M13噬菌體病毒,M13噬菌體病毒,M13噬菌體是一個(gè)雄性特異性大腸桿菌噬菌體，當(dāng)基因改造后的M13噬菌體病毒侵染了大腸桿菌細(xì)胞，就會(huì)通過細(xì)菌的

18、性菌毛與噬菌體的次要衣殼蛋白p3相互作用，去除主要衣殼蛋白p8，使噬菌體DNA能侵入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。被M13感染的細(xì)胞并不裂解而是繼續(xù)生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速率僅有正常的1/2至1/3。每個(gè)宿主細(xì)菌細(xì)胞每代可產(chǎn)生幾百個(gè)病毒顆粒，從細(xì)胞內(nèi)釋放后就可以在培養(yǎng)液中大量積累，產(chǎn)生不計(jì)其數(shù)的具有新外殼結(jié)構(gòu)的M13病毒顆粒。通過基因改造、侵染細(xì)胞、復(fù)制、組裝、釋放和擴(kuò)增等一步步生物過程，可獲得大量的、具有基因改造后的新衣殼蛋白結(jié)構(gòu)的噬菌體并得以應(yīng)用。,,3.

19、病毒制造的大事業(yè),制造病毒電池,鋰離子電池的工作原理,鋰離子電池由正極、負(fù)極和電解液組成。正極材料通常采用磷酸鐵鋰；負(fù)極采用石墨；電解液采用鋰鹽的有機(jī)溶劑溶液，以提供鋰離子。正極材料的鋰離子嵌入位點(diǎn)越多，電池電量越大。,當(dāng)常規(guī)的磷酸鐵鋰作為正極時(shí)，提供的鋰離子嵌入位點(diǎn)數(shù)量還不夠多，因此不能滿足手機(jī)電池長(zhǎng)時(shí)間待機(jī)的需求。,M13噬菌體作為生物模板來制備病毒電池,美國(guó)麻省理工學(xué)院的Belcher教授研究組提出！,(a) M13噬菌體分子,(

20、b) 周身p8衣殼蛋白吸附磷酸鐵,噬菌體分子進(jìn)行自組裝，裝配呈病毒電池的正極和負(fù)極石墨，之后，它們與鋰鹽電解液搭建成高效的病毒電池。,(c) 末端p3蛋白識(shí)別并“抓住”碳納米管,病毒電池,這種奇妙的病毒電池，具有儲(chǔ)能高、體積小、環(huán)境友好、常溫自組裝等優(yōu)點(diǎn)，功率比鋰電池提升10倍，手機(jī)的待機(jī)時(shí)間有望保持?jǐn)?shù)周甚至數(shù)月。,清除重金屬和化學(xué)品污染,六價(jià)鈾：具有致命威脅的核污染，能溶解在地下水中，隨地下水到處擴(kuò)散。治理核污染的重要手段：將可溶于

21、水的六價(jià)鈾還原成不溶于水的四價(jià)鈾。,清華大學(xué)的研究人員首先在溫和條件下快速合成了分散性很好的直徑約為10nm的球型單晶面心立方FCC-Fe納米顆粒，再進(jìn)一步利用M13噬菌體和FCC-Fe形成耦合體系，把攜帶著納米鐵顆粒的M13噬菌體病毒加入到含有六價(jià)鈾的污水中，納米鐵快速將六價(jià)鈾還原成不溶于水的、2~5nm的UO2納米晶，沉積在M13噬菌體病毒的表面，并可以和病毒顆粒一起，方便回收。,M13噬菌體上的Fe納米顆粒,1個(gè)FCC-Fe納米顆

22、粒,采用噬菌體介導(dǎo)的鐵納米顆粒高效還原六價(jià)鈾,處理鎘離子,鎘（Cd）離子：鎘可通過食物鏈于生物體內(nèi)富集，從而引起人體的慢性中毒，對(duì)腎、脾、胰等內(nèi)臟器官和毛發(fā)、骨骼都能產(chǎn)生不同程度的損害，鎘離子能溶解在水中，隨水到處流動(dòng)，污染擴(kuò)散。鎘的治理：利用單質(zhì)鐵還原鎘離子生成不溶于水的物質(zhì)。可利用攜帶納米鐵顆粒的M13噬菌體病毒加入到含鎘廢水中發(fā)生氧化還原反應(yīng)，并使不溶于水的鎘沉積在病毒表面而回收處理。由于還原生成的鎘顆粒易于覆蓋在零價(jià)鐵顆粒

23、的表面而導(dǎo)致氧化還原反應(yīng)效率顯著降低。,改進(jìn)方法,二價(jià)鎘離子,介導(dǎo)靶向給藥、醫(yī)學(xué)診斷或檢測(cè),噬菌體展示技術(shù)是一種大規(guī)模生物篩選技術(shù)，通過將不同的外源多肽或蛋白與M13噬菌體病毒的p3蛋白末端相融合，可以構(gòu)建得到含有大量待篩選多肽或蛋白分子的M13病毒庫，其數(shù)量在109~1011。,以某個(gè)靶標(biāo)蛋白或重要物質(zhì)為目標(biāo)進(jìn)行生物篩選，就可以快速獲得能和靶向目的物質(zhì)特異結(jié)合的多肽或蛋白分子。這些篩選得到的分子既可以作為一種檢測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)的試劑，也可以

24、作為“跟蹤導(dǎo)彈”，在生物體內(nèi)定向跑到靶標(biāo)物質(zhì)處。,癌細(xì)胞靶向定位,可見光成像SPECT成像CT成像和(e)為近紅外熒光成像,癌癥病灶處,病原檢測(cè)試紙,通過篩選得到的能與病原體表面抗原相結(jié)合的多肽或抗體蛋白分子，結(jié)合芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，人們已經(jīng)做出體積小巧、使用方便的病原檢測(cè)試紙。,同樣，只要篩選出能與人體血液中各種指標(biāo)分子相結(jié)合的多肽或蛋白分子，就可以制備出各種能快速檢測(cè)人體健康狀況的試紙。,通過噬菌體為模板構(gòu)建得到納米藥物,在p3蛋

25、白處連接上靶向定位病原體的抗體分子，在p8蛋白上通過化學(xué)修飾連接上藥物分子，可構(gòu)建得到一個(gè)高效的抗病菌納米藥物，比同等的普通藥物分子效果高出約20000倍。噬菌體作為基因傳遞載體，能將藥物基因分子運(yùn)送到人體細(xì)胞中，噬菌體對(duì)人體幾乎沒有任何副作用，穩(wěn)定性更好、基因運(yùn)載能力更強(qiáng)、相對(duì)易于制備，有望成為基因資料的一個(gè)重要武器。,噬菌體模板還能特異性結(jié)合人類神經(jīng)細(xì)胞，從而作為神經(jīng)細(xì)胞再生的模板，用于人類腦科疾病的治療。,制備化工新型催化劑,B

26、elcher教授研究小組將基因工程改造后的M13噬菌體模板與多種金屬氯化物溶液均勻混合再氧化，獲得了高效納米金屬催化劑。制備的噬菌體耦合納米鎳-銠-鈰催化劑用于乙醇重整制氫，可使催化反應(yīng)溫度從650℃下降到300℃。,光催化水分解,Belcher等采用M13噬菌體分子為支架，制備了光敏化劑鋅卟啉（ZnDPEG）和氧化銥共組裝的新型光催化劑，成功實(shí)現(xiàn)了光催化分解水制氫的氧化半反應(yīng)。,開發(fā)納米材料,病毒（噬菌體）分子由于具有合適的大小、明

27、確的結(jié)構(gòu)、可以進(jìn)行基因工程操作、能夠?qū)崿F(xiàn)自我復(fù)制增殖和自組裝等特性，因此可被廣泛用于納米顆粒、納米線、納米薄膜及多層納米材料的合成。,新型檢測(cè)器件（高精度變色檢測(cè)器）,顯色檢測(cè)是一種監(jiān)控大氣和水體污染物的常用方法。當(dāng)被測(cè)物經(jīng)過檢測(cè)器后，不同濃度的污染物呈現(xiàn)不同顏色的變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)污染物濃度的監(jiān)測(cè)。然而，常規(guī)的化學(xué)檢測(cè)方法通常不能直接對(duì)大氣和水體中的污染物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，且準(zhǔn)確性和靈敏度也通常不夠高，對(duì)濃度在檢出限意外的痕量有害化學(xué)品往

28、往無能為力。2014年，Nature Communications上報(bào)道了一種將基因工程改造后的M13噬菌體自組裝成為高特異性的病毒顯色檢測(cè)器的方法。該檢測(cè)器由納米級(jí)的、在基底材料上有序排列的M13噬菌體束或噬菌體層組成，噬菌體排布結(jié)構(gòu)的微小變化，會(huì)引起光散射的顯著不同，從而呈現(xiàn)肉眼可見的顏色差異。,新型檢測(cè)器件（高精度變色檢測(cè)器）,當(dāng)環(huán)境中存在待測(cè)的痕量化學(xué)品并接觸到噬菌體檢測(cè)器時(shí)，由于這些化學(xué)品急性的差異，會(huì)引起噬菌體排布結(jié)構(gòu)的迅

29、速變化，從而導(dǎo)致噬菌體檢測(cè)器呈現(xiàn)出顯著的顏色變化。根據(jù)待測(cè)有機(jī)物種類的不同，噬菌體檢測(cè)器會(huì)進(jìn)一步產(chǎn)生各種精細(xì)的色澤表現(xiàn)。,基因工程噬菌體顯色檢測(cè)痕量TNT（三硝基甲苯）,,4.放飛夢(mèng)想——病毒制造的大時(shí)代,M13噬菌體病毒給現(xiàn)代化學(xué)化工帶來的不僅僅是病毒電池、病毒計(jì)算機(jī)，未來的病毒產(chǎn)品將會(huì)超乎人類的想象，未來高速路上奔跑的汽車可以由病毒來驅(qū)動(dòng)，人們身上穿的衣服可以用病毒來保暖……然而，除了在生命科學(xué)、材料科學(xué)和工業(yè)生產(chǎn)方面的科學(xué)和應(yīng)用