2014年09月18日細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)課

1、細(xì) 胞 與 組 織 培 養(yǎng) 技 術(shù),李 呼 倫哈爾濱醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室 2014.09.18,前 言,,組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用,基礎(chǔ)研究工業(yè)化生產(chǎn),Park IH, et al. Cell. 2008 Sep 5;134(5):877-86.,病毒組織培養(yǎng)疫苗生產(chǎn),,基因工程產(chǎn)品,層析 和 超濾,分離、濃縮生物大分子 常用的手段,試管嬰兒,,,,,,,靜止培養(yǎng),旋轉(zhuǎn)培養(yǎng),振

2、蕩培養(yǎng),生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng),,厭氧培養(yǎng),一、細(xì)胞培養(yǎng)方式,二、體 外 培 養(yǎng) 的 分 類,體外培養(yǎng) in vitro細(xì)胞培養(yǎng) Cell culture 組織培養(yǎng) Tissue culture 器官培養(yǎng) Organ culture,體外培養(yǎng)種類,細(xì)胞培養(yǎng) （ Cell culture ）,培養(yǎng)物是單細(xì)胞或群體細(xì)胞 模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)?shù)臏囟群鸵欢ǖ臓I(yíng)養(yǎng)條件下，使之生長(zhǎng)生存維持結(jié)構(gòu)和功能的培養(yǎng)方法。,組織培養(yǎng)

3、（Tissue culture）,方法同上，使用組織塊(0.5-1mm3)或薄片(0.2mm),器官培養(yǎng)（Organ culture）,應(yīng)用和組織培養(yǎng)相似的條件，培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官，使之在體外生存、生長(zhǎng)和保持一定功能的方法使用器官原基或器官的一部分或整個(gè)器宮,三、組織與細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：能長(zhǎng)時(shí)間直接觀察活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)；可用于細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)和腫瘤學(xué)等多種學(xué)科的研究工作便

4、于觀察、記錄、攝影，直接觀察細(xì)胞變化 可供研究的細(xì)胞種類廣泛，從低等生物到高等動(dòng)物，以及人類；從胚胎到成體；從正常組織到腫瘤細(xì)胞皆可 便于使用不同方法研究細(xì)胞（相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、組織化學(xué)和同位素標(biāo)記等）,,培養(yǎng)細(xì)胞攜帶有與體內(nèi)細(xì)胞同等的基因組，是分子生物學(xué)和基因工程學(xué)的研究對(duì)象和組成部分可同時(shí)提供大量生物性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，耗資少，經(jīng)濟(jì)易于施加物理、化學(xué)和生物因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 已成為生物制品、基因工程制品、單克隆

5、抗體生產(chǎn)的必要手段,局限性： 組織和細(xì)胞離體以后，獨(dú)立生存在人工培養(yǎng)環(huán)境中，與體內(nèi)環(huán)境相比，仍有很大差異。故實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能推至體內(nèi)，輕易做出與體內(nèi)等同的結(jié)論,,四、組織與細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn),體內(nèi)外細(xì)胞的差異：當(dāng)人工條件和體內(nèi)實(shí)際情況不完全相同時(shí)，細(xì)胞在體外培養(yǎng)后，一旦失去神經(jīng)體液調(diào)節(jié)和細(xì)胞間相互影響，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中，發(fā)生變化則是必然。細(xì)胞最多見的表現(xiàn)是：返祖（Atavism）現(xiàn)象，即失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)、

6、分化減弱、細(xì)胞趨單一化、不死性、惡性狀態(tài)。細(xì)胞增殖和分化：是細(xì)胞生命進(jìn)化中所獲得的基本屬性，增殖使細(xì)胞數(shù)量增多；分化使機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能多樣化，最后演變成完整的有機(jī)體。,五、培養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài),貼附型能貼附在支持物表面生長(zhǎng)。大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞呈貼附性生長(zhǎng)；只依賴于貼附才能生長(zhǎng)貼附后，易失去其原有的特征，細(xì)胞分化現(xiàn)象常不顯著。在形態(tài)上表現(xiàn)單一化的現(xiàn)象，并常反應(yīng)其胚層起源，呈現(xiàn)類似“返祖現(xiàn)象”成纖維型細(xì)胞、上皮型細(xì)胞、游走型細(xì)胞及多形型細(xì)胞

7、 懸浮型,,成纖維型細(xì)胞細(xì)胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀 成纖維細(xì)胞 、心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞等,,上皮型細(xì)胞扁平不規(guī)則多角形，中有圓形核，細(xì)胞緊密相連成單層膜消化管外皮細(xì)胞、肝、胰、肺泡上皮、血管內(nèi)皮等,,游走型細(xì)胞在支持物上散在生長(zhǎng)，一般不連接成片。細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng)，速度快而且不規(guī)則神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,,多形型細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的

8、形態(tài) 神經(jīng)組織細(xì)胞,,懸浮型見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞和血液細(xì)胞胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)容易大量繁殖,六、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件,營(yíng)養(yǎng)生存環(huán)境溫度: 37 ℃O2CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.0-7.2 滲透壓無污染無毒,組織培養(yǎng)室的設(shè)施及條件,壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒。用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2小時(shí)）。主要用干玻

9、璃器皿消毒 濾器：過濾除菌。大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌 超凈工作臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈 ：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒,七、無 菌 操 作,,,無菌室的滅菌定期打掃無菌室實(shí)驗(yàn)前滅菌實(shí)驗(yàn)后滅菌實(shí)驗(yàn)人員的無菌準(zhǔn)備肥皂洗手穿隔離衣酒精棉球擦手,無菌操作中常犯的錯(cuò)誤,吸管、剪刀等碰到其他器皿,無菌操作中常犯的錯(cuò)誤,正確的拿管姿勢(shì),錯(cuò)誤的拿管

10、姿勢(shì),拿吸管時(shí)手碰到無菌區(qū),無菌操作中常犯的錯(cuò)誤,培養(yǎng)基浸濕吸管底部的棉花,八、細(xì) 胞 和 組 織 培 養(yǎng),將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。1、組織塊培養(yǎng) 直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個(gè)小時(shí)后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。2、細(xì)胞培養(yǎng) 一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長(zhǎng)狀態(tài)。

11、,計(jì) 數(shù) 細(xì) 胞,細(xì)胞數(shù)/ml=計(jì)數(shù)16格×稀釋倍數(shù) ×104,,,,,細(xì)胞數(shù)/ml=計(jì)數(shù)16格個(gè)數(shù)/個(gè)數(shù)×稀釋倍數(shù)×104,培養(yǎng)細(xì)胞的觀察,每隔一定時(shí)間觀察一次是否生長(zhǎng)良好形態(tài)是否正常有無污染培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示）定時(shí)檢查培養(yǎng)溫度和CO2濃度,概 念,原代培養(yǎng) 直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進(jìn)行傳代培養(yǎng)（Sub

12、culture）的細(xì)胞，便不再稱為原代培養(yǎng)，而改稱為細(xì)胞系。 傳代培養(yǎng) 細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細(xì)胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細(xì)胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或細(xì)胞株則可無限地傳代下去。,取 材,理論上講各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實(shí)際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個(gè)體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容

13、易培養(yǎng)。,細(xì) 胞 培 養(yǎng) 的 準(zhǔn) 備 工 作,,九、原 代 培 養(yǎng),,組 織 塊 法,新鮮取材的組織中 細(xì)胞仍具有分裂增殖的能力。將組織切成小塊培養(yǎng)在模擬體內(nèi)的環(huán)境中，小塊組織的細(xì)胞可以游離出來，從培養(yǎng)液中吸取營(yíng)養(yǎng)，繼續(xù)分裂生長(zhǎng)。 組織塊培養(yǎng)法適用范圍廣，常用于肝臟、皮膚、角膜、骨骼、韌帶、血管、神經(jīng)、心臟等器官和組織的培養(yǎng)。,培 養(yǎng) 要 點(diǎn),材料新鮮嚴(yán)格無菌操作剔除脂肪等附著組織組織塊剪小（直徑﹤1mm）擺放

14、開（間距﹥5mm）,常 犯 的 錯(cuò) 誤,操作中不換器械沖洗次數(shù)不夠組織碎片太大組織塊擺放太密培養(yǎng)液加入太多,消 化 培 養(yǎng) 法,消化培養(yǎng)法所用的酶有多種，目前應(yīng)用最廣的是胰蛋白酶。它是一種內(nèi)切酶，可專一水解有精胺酸或賴氨酸的羧基形成的肽鍵。從而消除妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞間質(zhì)，包括基質(zhì)、纖維等，使細(xì)胞分散，易于貼壁并從外界吸收養(yǎng)分和排除代謝物 。消化法適用于組織量大的原代培養(yǎng)。胰蛋白酶液適用于消化間質(zhì)少的組織，如羊膜、胚胎、上皮、肝

15、和腎等組織及傳代細(xì)胞。,培 養(yǎng) 要 點(diǎn),組織剪碎至1mm3左右合適的胰蛋白酶濃度（通常為0.25%）合適的消化時(shí)間：消化時(shí)，待組織塊變得較疏松，顏色略白為止（通常為37℃，20～40分鐘）,常 犯 的 錯(cuò) 誤,水浴鍋未預(yù)熱,組織塊太大,胰蛋白酶消化不足或過度,吹打用力過重,常 犯 的 錯(cuò) 誤,十、傳 代 細(xì) 胞 培 養(yǎng),細(xì)胞在原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的操作叫傳代。為獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株，或大量的同種細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞形成致密的單

16、層后需進(jìn)行傳代培養(yǎng)。,細(xì) 胞 傳 代 方 法,根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn)，傳代方法有3種懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l/2～2/3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 采用酶

17、消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液,貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法,吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液PBS洗一次加入1～2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）靜置2～10 min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液吸取1/10～1/40細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),Trypsin

18、消化細(xì)胞,未消化細(xì)胞,消化的細(xì)胞,培 養(yǎng) 要 點(diǎn),嚴(yán)格的無菌操作適度消化,細(xì)胞培養(yǎng)中需要注意的問題,培養(yǎng)液和培養(yǎng)物的比例：一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細(xì)胞生長(zhǎng)，不能盲目增加每單位體積的細(xì)胞濃度PH：初培養(yǎng)pH應(yīng)為7.4，培養(yǎng)過程應(yīng)不低于7.0培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的空間：一般培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:10,細(xì)胞培養(yǎng)中需要注意的問題,容積、深度、表面面積：培養(yǎng)液體積與表面面積的比例為0.2～0.5ml/cm2。需高濃度氧的

19、，在淺的培養(yǎng)液（2mm）中生長(zhǎng)較好；需要低濃度氧的,在深的培養(yǎng)液（5mm）中生長(zhǎng)較好。去除死細(xì)胞溫度控制：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)溫度波動(dòng)的敏感性很大。溫度低于36.5℃，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；溫度高于37.5℃，細(xì)胞存活力降低,十一、細(xì) 胞 凍 存 和 復(fù) 蘇,,細(xì)胞凍存的意義,細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化,凍存細(xì)胞的理論基礎(chǔ),當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化

20、：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶,凍存和復(fù)蘇的原則,慢 凍 快 融,細(xì) 胞 凍 存 方 法,預(yù)先配制凍存液： 90%血清 10%DMSO （二甲基亞砜）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，

21、加入適量?jī)龃嬉海梦艽荡蛑瞥杉?xì)胞懸液（1×106～5×106細(xì)胞/ml)加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期,慢 凍 程 序,標(biāo)準(zhǔn)程序當(dāng)溫度在-25 ℃以上時(shí)，1～2 ℃/min當(dāng)溫度達(dá)-25 ℃以下時(shí)，5～10℃/min當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中簡(jiǎn)易程序 將凍存管于4℃放置1小時(shí)，于-20℃放置1小時(shí)， -80℃放置1小時(shí)/通過線繩將裝有冷凍管的紗布袋固定于

22、液氮罐罐口（-70℃），放置1小時(shí)，后直接投入液氮中（-196℃）,細(xì) 胞 復(fù) 蘇 方 法,從液氮中取出凍存管，在37～38℃水浴中快速使其融化（1分鐘左右）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上低速離心10分鐘去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞,十二、 ATCC入庫(kù)細(xì)胞要求,培養(yǎng)簡(jiǎn)歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細(xì)胞已傳代數(shù)等 凍 存 液：培養(yǎng)基和防凍液名稱細(xì)胞活力：融解前后

23、細(xì)胞接種存活率和生長(zhǎng)特性培 養(yǎng) 液：培養(yǎng)基種類和名稱（一般要求不含抗生素）、血清來源和含量細(xì)胞形態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細(xì)胞等，融解后細(xì)胞生長(zhǎng)特性核 型：二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體的有無無污染檢測(cè)：包括細(xì)菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等物種檢測(cè)：檢測(cè)同工酶，主要為G6PD和LDH，以證明細(xì)胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè)免疫檢測(cè)：一兩種血清學(xué)檢測(cè)細(xì)胞建立者：建立者姓名；檢測(cè)者姓名,中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,中國(guó)典型培養(yǎng)物