線粒體的分離

1、1實驗三實驗三線粒體的分離、超活染色與觀察線粒體的分離、超活染色與觀察一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)差速離心法分離動、植物線粒體技術(shù)。2、觀察動、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體的形態(tài)、數(shù)量與分布。3、學(xué)習(xí)細(xì)胞器的超活染色技術(shù)。二、實驗原理二、實驗原理利用沉降系數(shù)不同的顆粒，在一定介質(zhì)中沉降速度的差異，采取分級差速離心的方法，將線粒體從細(xì)胞懸液中逐級分離出來。離心用的懸浮介質(zhì)通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細(xì)胞器的

2、結(jié)構(gòu)和酶的活性，在pH7.2的條件下，亞細(xì)胞組分不容易重新聚集，有利于分離。整個操作過程應(yīng)注意使樣品保持4℃，避免酶失活?；铙w染色是指對生活有機體的細(xì)胞或組織能著色但又無毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細(xì)胞的生命活動和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡，可用來研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。體外活體染色又稱超活染色，它是由活的動、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以活體染料溶液浸染，染料

3、被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色。詹納斯綠B（JanusgreenB）和中性紅（neutralred）兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對于線粒體的染色各有專一性。線粒體的鑒定用詹納斯綠活染法。詹納斯綠B（JanusgreenB）是對線粒體專一的活細(xì)胞染料，毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸引堆積在線粒體膜上。線粒體的細(xì)胞色素氧化酶使該染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無色。三、實

4、驗材料與方法三、實驗材料與方法1、材料：人口腔上皮細(xì)胞、大鼠肝臟、玉米黃化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）、洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞。2、主要試劑和儀器：Ringer溶液，10%、13000中性紅溶液，1%、15000詹納斯綠B溶液；分離介質(zhì)：0.25molL蔗糖、50mmolL的Tris鹽酸緩沖液（pH7.4），3mmolLEDTA，0.75mgml牛血清白蛋白（BSA），50mmolL的TrisHCl緩沖液(pH7.4)，0.3molL甘露醇

5、（pH7.4）、20%次氯酸鈉（NaClO）溶液、1%詹納斯綠B染液，生理鹽水，0.25molL蔗糖＋0.01molLTris鹽酸緩沖液(pH7.4)，0.34molL蔗糖＋0.01molLTris鹽酸緩沖液(pH7.4)，固定液，姬姆薩染液，115molL磷酸鹽緩沖液（pH6.8）。溫箱，冰箱，冷凍控溫高速離心機（或普通高速離心機），高速離心機，顯微鏡，恒溫水浴鍋，解剖盤，玻璃勻漿器，剪刀、鑷子，雙面刀片，載玻片，凹面載玻片，蓋玻片，

6、漏斗，小燒杯，表面皿，吸管，牙簽，吸水紙，紗布，瓷研缽，尼龍織物。四、實驗方法四、實驗方法（一）大鼠肝線粒體的分離（一）大鼠肝線粒體的分離1、制備大鼠肝細(xì)胞勻漿。實驗前大鼠空腹12h，擊頭處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽3分離線粒體分離線粒體混合上清液10000g離心10↓↓↓沉淀（線粒體）上清液（棄去）↓洗滌，加0.25molL預(yù)冷蔗糖溶液6mL10000g離心10min重復(fù)洗滌兩次↓↓↓沉淀（線粒體）上清液（制一張涂片，后棄去）（二）玉

7、米線粒體的分離（二）玉米線粒體的分離1、玉米種子用20%次氯酸鈉溶液浸泡10min消毒，清水沖洗30min，再浸泡清水15h。將種子平鋪在放有濕紗布的盤內(nèi)，保持濕度，置溫箱28℃于暗處培育2－3d。待芽長到1－2cm長時剪下下約15g，放0－4℃1h。2、加3倍體積分離介質(zhì)，在瓷研缽內(nèi)快速研磨成勻漿。3、用多層紗布過濾，濾液經(jīng)700g離心10min。除去核和雜質(zhì)沉淀。4、取上清液10000g離心10min，沉淀為線粒體。再同上離心洗滌一

8、次。5、沉淀為線粒體，可存于0.3molL甘露醇中，注意以上勻漿化及離心均控制在0－4℃進(jìn)行。6、線粒體的觀察：取線粒體沉淀涂在清潔的載玻片上，不待干立即滴加1%詹納斯綠B染色20min，放上蓋玻片，用顯微鏡觀察，線粒體是藍(lán)綠色圓形顆粒。（三）人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察（三）人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察1、取清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上，滴2滴15000詹納斯綠B染液。2、實驗者用牙簽鈍端在自己口腔頰粘

9、膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞，將刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中，染色10－15min（注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液），蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。3、在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細(xì)胞，換高倍鏡或油鏡進(jìn)行觀察?？梢姳馄綘钌掀ぜ?xì)胞的核周圍胞質(zhì)中，分布著一些被染成藍(lán)綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即是線粒體。（四）洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察（四）洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察1、用吸管吸取15