實(shí)驗(yàn)一 制霉菌素發(fā)酵、提取與效價(jià)測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一制霉菌素發(fā)酵、提取與效價(jià)測(cè)定制霉菌素發(fā)酵、提取與效價(jià)測(cè)定1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求(1)了解抗生素發(fā)酵的一般過程及發(fā)酵過程中一些重要理化指標(biāo)檢測(cè)方法；(2)學(xué)習(xí)抗生素（制霉菌素）的提取純化工藝；(3)了解制霉菌素化學(xué)效價(jià)測(cè)定的原理；(4)掌握抗生素生物效價(jià)測(cè)定的常規(guī)方法——管碟法的原理與操作。2.實(shí)驗(yàn)原理2.1制霉菌素制霉菌素(nystatinmycostatinfungicidin)是由諾爾斯鏈霉菌(Streptomycesnou

2、rsei)產(chǎn)生的一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類(polyenemacrolides)抗真菌抗生素抗真菌抗生素。此類抗生素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是在分子中既有經(jīng)內(nèi)酯化作用而閉合的大碳環(huán)，又有一系列的共軛雙鍵。制霉菌素存在于菌絲體中，其純品為淡黃色微細(xì)晶體；不溶于水、氯仿和丙酮等；稍溶于低級(jí)醇等；溶于吡啶、冰醋酸和NaOH溶液，但均能使其破壞而失效；對(duì)較高和較低的pH以及光和熱均不穩(wěn)定。臨床上使用的制霉菌素，其主要成分為制霉菌素A1，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如

3、下圖所示：它的氨基糖部分是氨基海藻糖，即3氨基36二脫氧D吡喃甘露糖，非糖部分為38員的多烯大環(huán)內(nèi)酯。制霉菌素對(duì)各種真菌如白色念珠菌、隱球菌、莢膜組織胞漿菌及球孢子菌等有抑制作用。主要用于白色念珠菌感染，如消化道念珠菌病、鵝口瘡、念珠菌性陰道炎及外陰炎等。但口服治療全身性真菌感染或深部真菌感染則無效。制霉菌素的作用機(jī)理是與真菌細(xì)胞膜上的特異甾醇相結(jié)合，導(dǎo)致原生質(zhì)膜破壞，制霉菌素的作用機(jī)理是與真菌細(xì)胞膜上的特異甾醇相結(jié)合，導(dǎo)致原生質(zhì)膜破壞

4、，“藥品生產(chǎn)管理規(guī)范”（即GMP）的規(guī)定。抗生素精制可選用的步驟有：脫色和去熱源質(zhì)、結(jié)晶和重結(jié)晶、共沸蒸餾法、柱層析法、鹽析法、中間鹽轉(zhuǎn)移法和分子篩等。2.3抗生素的效價(jià)與測(cè)定通常用效價(jià)效價(jià)來衡量抗生素發(fā)酵液中抗生素含量?？股匦r(jià)測(cè)定可采用化學(xué)法或生物效價(jià)測(cè)定法。生物效價(jià)測(cè)定法有稀釋法、比濁法和擴(kuò)散法三大類。管碟法是擴(kuò)散法的一種，是最常用的測(cè)定抗生素效價(jià)的方法。據(jù)此，效價(jià)即可視為用抗菌效力表示的抗生素的有效含量。管碟法就是在接種有敏感

5、實(shí)驗(yàn)菌的瓊脂平板上放上牛津杯，然后向杯內(nèi)加滿抗生素溶液，保溫培養(yǎng)一定時(shí)間后，抗生素滲透到一定的范圍，抑制敏感菌的生長(zhǎng)，產(chǎn)生透明圈。抑菌圈的半徑與抗生素在管中的總量（單位）、抗生素的擴(kuò)散系數(shù)（cm2h）、擴(kuò)散時(shí)間（即抗生素溶液注入牛津杯至出現(xiàn)抑菌圈所需的時(shí)間）、培養(yǎng)基的厚度(mm)和最低抑菌濃度(UmL)等有關(guān)?？股乜偭康膶?duì)數(shù)和抑菌圈直徑的平方呈直線關(guān)系。因此，抗生素的效價(jià)可以由抑菌圈的大小來衡量。將已知效價(jià)的制霉菌素標(biāo)準(zhǔn)液制成標(biāo)準(zhǔn)曲線

6、，比較已知效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)液與未知效價(jià)的被檢溶液的抑菌圈的大小，就可算出樣品中抗生素的效價(jià)。3.實(shí)驗(yàn)材料3.1菌種諾爾斯鏈霉菌(Streptomycesnoursei)A94：制霉菌素產(chǎn)生菌；黑曲霉（Aspergillusniger）：制霉菌素敏感菌。3.2培養(yǎng)基（1）孢子斜面培養(yǎng)基：牛肉膏0.28%，飴糖3.5%，蛋白胨0.4%，瓊脂2.0%，pH7.5，121℃滅菌30min，制成斜面。37℃培養(yǎng)2d證明無菌后繼續(xù)在37℃放置直至斜面冷凝水

7、干后取出備用。（可用PDA培養(yǎng)基代替）（2）肉湯培養(yǎng)基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，牛肉膏0.6%，NaCl0.5%，pH7.2，每升培養(yǎng)基加1%酚紅溶液0.3mL，121℃滅菌30min，經(jīng)37℃培養(yǎng)2d證明無菌備用。（種子瓶無菌檢查用）（3）細(xì)菌瓊脂斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，牛肉膏0.6%，NaCl0.5%，瓊脂2%，pH7.2，121℃滅菌30min，經(jīng)37℃培養(yǎng)2d證明無菌備用。（種子瓶無菌檢查用）（4）液體種子培養(yǎng)基：淀