動(dòng)物細(xì)胞基因組dna中小衛(wèi)星多態(tài)性的southern blot檢測(cè)

1、動(dòng)物細(xì)胞基因組動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA中小衛(wèi)星多態(tài)性的中小衛(wèi)星多態(tài)性的Southernblot檢測(cè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆蘸怂犭s交檢測(cè)技術(shù)（Southernblotting技術(shù)）、核酸探針的標(biāo)記技術(shù)、小衛(wèi)星DNA多態(tài)性檢測(cè)分析技術(shù)（DNA指紋圖譜技術(shù)）和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理：Southern印跡雜交技術(shù)包括兩個(gè)主要過程：一是將待檢測(cè)的核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移（電轉(zhuǎn)印、虹吸轉(zhuǎn)印、真空轉(zhuǎn)?。┎⒔Y(jié)合到一定的固相支持物（硝酸纖維素、尼龍膜）上，即

2、印跡（blotting）；二是固定于膜上的核酸與特定標(biāo)記[放射性同位素、地高辛（DIG）、生物素（biotin）等]的核酸探針在一定溫度和離子強(qiáng)度下復(fù)性（退火），即分子雜交。該技術(shù)是1975年英國(guó)愛丁堡大學(xué)Southern發(fā)明的，固命名Southern印跡雜交技術(shù)。利用Southern印跡雜交技術(shù)可進(jìn)行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組中某一基因的定性和定量分析、基因突變分析及限制性長(zhǎng)度片段多態(tài)性分析（RFLP）。固相膜核酸分子雜交的主要步

3、驟及原理如下：1、DNA的變性：DNA變性解鏈?zhǔn)请s交成功的關(guān)鍵。Southern印跡雜交時(shí)DNA在凝膠中變性，變性方法是將凝膠浸在數(shù)倍體積的1.5MNaCl和0.5MNaOH中1h然后用數(shù)倍體積的1MTrisHCl(pH8.0)和1.5MNaCl溶液中和1h。DNA受酸、堿、熱等處理均能發(fā)生變性，但強(qiáng)酸會(huì)使核酸降解。一般認(rèn)為堿變性較好，可避免DNA降解。熱變性在要低DNA濃度（100μgml）和低鹽濃度（0.1MSSC含15mMNaCl

4、1.5mM檸檬酸三鈉，pH7.0）下進(jìn)行。用SSC稀釋DNA溶液為50μgml，加10MNaOH使最終濃度為0.1M（pH約12.8），室溫變性10min，很快置冰鹽水中，用10MHCl或5MNaH2PO4調(diào)pH到7~8（亦可用堿變性后，調(diào)至中性，再加熱100℃10min），DNA變懷可用OD260增加（約30~40%）來檢測(cè)，變性DNA沉淀呈雪樣，完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12SSC，冰浴保存。2、變性DNA在硝酸纖維素膜

5、上的固定：硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45μm）先在蒸餾水中充分浸泡，再用6SSC浸泡30min~2h，涼干。DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后，先室溫干燥4h，然后在80℃真空干燥2h。DNA樣品也可以轉(zhuǎn)移或加至尼龍膜（nylonmembrane）上，再用高溫烘烤或紫外交聯(lián)的處理固定在尼龍膜上。3、預(yù)雜交：濕潤(rùn)的濾膜放入可加熱封口的塑料袋或雜交管中，按每平方厘米濾膜加0.2ml預(yù)熱至60℃的預(yù)雜交液（6SSC，0.5%SDS，5Denh

6、ardt液，100μgml鮭魚精DNA）。鮭魚精DNA需經(jīng)過剪切和DNA酶消化處理，然后酒精沉淀純化，調(diào)濃度至10mgml，用前放100℃水浴中煮沸變性10min，冰水驟冷。若在塑料袋中雜交，盡可能將袋中氣泡趕盡，可封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68℃水浴保溫3~12h。當(dāng)預(yù)雜交液溫度升至68℃時(shí)，在濾膜表面常會(huì)形成小氣泡。輕輕晃動(dòng)袋中液體即可除去這些小氣泡，這一點(diǎn)對(duì)于保證濾膜表面充分浸潤(rùn)預(yù)雜交液很重要。若在雜交管中雜交，只需將雜交管置

7、入核酸雜交爐（箱）內(nèi)的旋轉(zhuǎn)支架，調(diào)解到到一定轉(zhuǎn)速和雜交溫度，完成雜交。4、雜交：從水浴中取出塑料袋，用剪刀剪開一角，盡可能擠凈預(yù)雜交液。用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中，用恰好是足量的液體保持濾膜濕潤(rùn)（50μlcm2）。溶液的組成是6SSC，0.01MEDTA變性的標(biāo)記核酸探針，5Denhardt液，0.5%SDS100μgml變性的鮭魚精DNA。盡可能趕盡氣泡后，將塑料袋嚴(yán)密封口，雜交反應(yīng)在68℃水浴中進(jìn)行，所需時(shí)間視探針和檢測(cè)靶DNA

8、的性質(zhì)及探針的比活性等情況而定，一般4~20h。若在雜交管中雜交，只需傾去預(yù)雜交液，雜交管內(nèi)加入含雜交探針的雜交液，繼續(xù)在核酸雜交爐完成雜交。圖252Southernblot技術(shù)逐步圖解實(shí)驗(yàn)材料：[1].實(shí)驗(yàn)24制備的基因組DNA。實(shí)際應(yīng)用中可采集人靜脈血EDTA抗凝，提取DNA。[2].限制性內(nèi)切酶HaeIII：FermentasLifeSciences[3].限制性內(nèi)切酶HinfI：FermentasLifeSciences[4].