DNA損傷修復(fù)基因多態(tài)性與肺癌的遺傳易感性及藥物基因組學(xué)研究.pdf

1、第一部分 DNA修復(fù)基因遺傳變異與肺癌易感性研究
　　第一節(jié) GTF2H1基因多態(tài)與肺癌遺傳易感性研究
　　肺癌已成為全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的癌癥,80-90％肺癌的發(fā)生與吸煙有著重要的聯(lián)系,但只有10-15％吸煙者會(huì)得肺癌,提示遺傳因素、遺傳多態(tài)性在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。DNA修復(fù)基因多態(tài)性作為個(gè)體損傷修復(fù)能力差異的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ),可能是肺癌的遺傳易感因素。
　　GTF2H1(p62)蛋白在核苷酸切除修復(fù)(N

2、ER)通路中發(fā)揮重要作用,參與XPC-HR23B蛋白早期損傷識(shí)別,并招募核酸內(nèi)切酶XPG到損傷部位完成酶切過(guò)程。此外,GTF2H1蛋白參與轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄激活。
　　我們推測(cè)GTF2H1基因上的遺傳變異可能單獨(dú)或聯(lián)合影響中國(guó)人群肺癌的遺傳易感性。為了驗(yàn)證這一假設(shè),我們?cè)谥袊?guó)漢族人群的500例肺癌患者和517例年齡、性別與之相匹配的正常對(duì)照中,對(duì)GTF2H1基因上的6個(gè)單核苷酸多態(tài)(SNPs)位點(diǎn)進(jìn)行了基因分型,探討了GTF2

3、H1基因的遺傳多態(tài)對(duì)肺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的影響。同時(shí),為研究-79 C＞T多態(tài)改變對(duì)GTF2H1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,我們構(gòu)建了分別含有C和T等位基因的GTF2H1啟動(dòng)子區(qū)域的pGL3-Basic報(bào)告基因載體,進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)錄活性實(shí)驗(yàn)。
　　我們發(fā)現(xiàn),在顯性模型下,3個(gè)SNP位點(diǎn)的突變基因型與野生型相比顯著增加肺癌風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng),rs3802967(校正OR=1.38;95％CI=1.04-1.82),rs4150606(校正OR=1.44;95％

4、CI=1.08-1.92)和rs4150678(校正OR=1.37;95％CI=1.04-1.81)。Rs3802967 C/T+T/T基因型在男性人群中風(fēng)險(xiǎn)性更加顯著(P=0.002)。rs4150667顯示出與肺癌的負(fù)相關(guān),這一風(fēng)險(xiǎn)在隱性模型下更為顯著(校正OR=0.59,95％CI=0.38-0.93)。單倍型分析顯示單倍型“222212”(1代表常見(jiàn)等位基因,2代表罕見(jiàn)等位基因)顯著增加肺癌患病風(fēng)險(xiǎn)性(P=0.03)。熒光素酶報(bào)

5、告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示攜帶T-等位基因報(bào)告基因載體有更高的熒光素酶表達(dá)活性,提示-79C→T改變可能影響GTF2H1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。因此,我們認(rèn)為GTF2H1單核苷酸/單倍型多態(tài)可能與中國(guó)人群肺癌遺傳易感性有關(guān)。
　　第二節(jié) Rad52基因多態(tài)與肺癌遺傳易感性和藥物基因組學(xué)研究
　　煙草等外源物質(zhì)的暴露會(huì)造成雙鏈斷裂(DSBs)。同源重組(HR)修復(fù)是真核生物雙鏈斷裂損傷修復(fù)的主要方式,對(duì)于維持哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組完整性十分重要。

6、Rad52在同源重組早期結(jié)合到DSBs上,保護(hù)它免于外切核酸酶的攻擊,并協(xié)助由Rad51介導(dǎo)的同源重組的發(fā)生,在肺癌發(fā)生過(guò)程中扮演重要角色。
　　我們?cè)谥袊?guó)漢族人群的500例肺癌患者和517例年齡、性別與之相匹配的正常對(duì)照中,對(duì)Rad52基因上的9個(gè)單核苷酸多態(tài)(SNPs)位點(diǎn)進(jìn)行了基因分型,探討了Rad52基因的遺傳多態(tài)對(duì)肺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的影響。同時(shí),為研究3'UTR-104G＞A多態(tài)改變對(duì)Rad52基因的表達(dá)水平調(diào)控作用,我們構(gòu)建

7、了分別含有G和A等位基因的Rad523'UTR區(qū)域的pGL3-Promoter報(bào)告基因質(zhì)粒,進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)錄活性實(shí)驗(yàn)。并通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)和SPR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了等位基因間表達(dá)差異的分子機(jī)理。
　　單位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn),Rad52基N3個(gè)位于調(diào)控區(qū)SNP rs10774474(P=0.002)。Rs11571378(P=1.647×10-5),rs1051669(P=0.002)在肺癌病例和對(duì)照組中的分布具有顯著差異,經(jīng)Bonferr

8、oni多重校正后,關(guān)聯(lián)均仍具有顯著性。全局顯著性檢驗(yàn)表明rs10774474-rs11571378構(gòu)成的單倍型在病例組和對(duì)照組中的分布頻率存在顯著差異(P=0.007),10000次置換檢驗(yàn)后,關(guān)聯(lián)仍顯著。單倍型‘12’(順序?yàn)閞s10774474-rs11571378,1代表常見(jiàn)等位基因,2代表罕見(jiàn)等位基因)具有風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)。對(duì)rs1051669(104G＞A)多態(tài)功能研究表明:rs1051669-A報(bào)告載體熒光素酶報(bào)告基因相對(duì)活性下降。

9、運(yùn)用DINAMelt軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),G等位基因自由能更低,其可能通過(guò)形成更穩(wěn)定的局部二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)穩(wěn)定mRNA增強(qiáng)報(bào)告基因的表達(dá)。同時(shí),SPR實(shí)驗(yàn)顯示,突變型A-等位基因RNA與胞質(zhì)抽提物調(diào)控因子結(jié)合能力更強(qiáng)。提示104G→A改變可能增強(qiáng)Rad52基因與負(fù)調(diào)控因子的結(jié)合而降低Rad52基因表達(dá)水平。以上結(jié)果提示Rad52基因單核苷酸多態(tài)可能與中國(guó)人群肺癌遺傳易感性有關(guān),在肺癌發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分非小細(xì)胞肺癌鉑類(lèi)藥物化療

10、藥物基因組學(xué)研究
　　第一節(jié) XPD基因與非小細(xì)胞肺癌鉑類(lèi)藥物化療關(guān)聯(lián)分析
　　非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌的80％,其中2/3的患者在確診時(shí)已處于晚期(Ⅲ或Ⅳ期),失去了手術(shù)機(jī)會(huì)。
　　鉑類(lèi)藥物(順鉑、卡鉑)是目前治療晚期NSCLC的主要化學(xué)藥物。鉑進(jìn)入細(xì)胞后,與DNA結(jié)合形成鉑-DNA加合物,導(dǎo)致DNA鏈間交聯(lián)或鏈內(nèi)交聯(lián),引起細(xì)胞死亡。DNA損傷修復(fù)能力的

11、差異可能是決定鉑類(lèi)藥物療效的重要因素。XPD在機(jī)體核苷酸切除修復(fù)(NER)中扮演重要角色,擁有5’-3’DNA解旋酶活性,行使NER以及基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄過(guò)程中DNA結(jié)鏈作用。我們推測(cè),XPD基因遺傳多態(tài)可能影響DNA損傷的修復(fù)移除能力,而導(dǎo)致個(gè)體間療效差異。鑒于此,我們觀察了445例接受鉑類(lèi)為主化療的NSCLC患者治療后情況,采用MassARRAY時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)檢測(cè)XPD基因三個(gè)潛在功能位點(diǎn)(p.Arg156Arg,p.Asp312A

12、sn,p.Asp711Asp)遺傳多態(tài),以探討該基因單核苷酸多態(tài)與NSCLC患者對(duì)鉑類(lèi)藥物化療療效,毒副反應(yīng)及預(yù)后的關(guān)系。
　　非條件logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),XPD基因p.Arg156Arg位點(diǎn)純合突變A/A基因型顯著增加患者發(fā)生3-4度血液毒性風(fēng)險(xiǎn)性,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),該遺傳多態(tài)與3-4度白細(xì)胞毒性顯著相關(guān)(趨勢(shì)檢驗(yàn)P=0.007),經(jīng)Bonferroni多重校正后,關(guān)聯(lián)均具有顯著性。單倍型/二倍型分析顯示,單倍型‘CG’的

13、攜帶者發(fā)生白細(xì)胞毒性的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低,經(jīng)過(guò)10,000次置換檢驗(yàn)后,關(guān)聯(lián)均具有顯著性。在諾維本聯(lián)合順鉑用藥人群中,XPD p.Arg156Arg突變基因型A/A顯著增加鉑類(lèi)藥物敏感性(P=0.003),血液毒性風(fēng)險(xiǎn)性(P=0.012),白細(xì)胞毒性風(fēng)險(xiǎn)性(P=0.003)。XPD p.Asp312Asn,p.Asp711Asp多態(tài)與肺癌患者總生存期顯著相關(guān)(10g-rankP分別為0.006,0.006)。XPDp.Asp312Asn多態(tài)在

14、ⅢB期人群中與預(yù)后關(guān)聯(lián)更加顯著(10g-rank P=7.25×10-5)。
　　本研究首次發(fā)現(xiàn),XPD基因遺傳多態(tài)與晚期肺癌患者鉑類(lèi)藥物化療后的血液毒性,總生存期顯著相關(guān)。XPD p.Arg156Arg,p.Asp312Asn,p.Asp711Asp單核苷酸多態(tài)性有可能作為檢測(cè)指標(biāo)來(lái)預(yù)測(cè)鉑類(lèi)藥物的不良反應(yīng)和預(yù)后風(fēng)險(xiǎn),成為指導(dǎo)該類(lèi)藥物的個(gè)體化用藥的依據(jù)。
　　第二節(jié)中國(guó)人群晚期非小細(xì)胞肺癌鉑類(lèi)為主化療藥物基因組學(xué)研究

15、　　鉑類(lèi)耐藥由多種因素引起,包括藥物解毒增加;DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng);細(xì)胞耐受性增加等。核苷酸切除修復(fù)(NER)主要修復(fù)各種大片段DNA損傷造成的DNA雙螺旋扭曲,如鏈內(nèi)交聯(lián),同源重組(HR)修復(fù)鏈間交聯(lián)(ICL),錯(cuò)配修復(fù)(MMR)對(duì)藥物所致的加合物的識(shí)別及處理產(chǎn)生一種前凋亡信號(hào)。此外,葉酸代謝,炎癥因子等因素均與鉑類(lèi)耐藥相關(guān)。
　　本部分研究收集445例以鉑類(lèi)藥物為主化療NSCLC患者血樣及其臨床資料,采用候選通路策略,選擇了

16、以上通路XPC,XPF,XPG,MLH1,MSH2,MTHFR,XRCC3,lig4,Rad52,IL-1a,IL-1b等11個(gè)關(guān)鍵基因的17個(gè)SNP位點(diǎn),通過(guò)基因多態(tài)與化療近期療效、不良反應(yīng)及遠(yuǎn)期生存期的關(guān)聯(lián)分析,尋找與NSCLC患者對(duì)鉑類(lèi)藥物敏感性相關(guān)的基因及其多態(tài)位點(diǎn)。
　　單位點(diǎn)分析表明,MTHFR rs1801131與化療敏感性相關(guān)。接受諾維本聯(lián)合鉑類(lèi)用藥亞組人群分層分析發(fā)現(xiàn)Rad52 rs1051669 A/A基因型增

17、加化療療效敏感性。7個(gè)基因上的9個(gè)SNP多態(tài)與不良反應(yīng)顯著相關(guān)。False discovery rate多重校正后,IL-1b rs16944(-511 C＞T),rs1143627(-31T＞C)與3-4度白細(xì)胞毒性和3-4度粒細(xì)胞毒性關(guān)聯(lián)仍具有顯著性。分層分析顯示,rs16944與3-4度白細(xì)胞毒性相關(guān)性在非吸煙人群中更顯著(校正OR=5.10,95％CI=2.31-11.19,P=5.41×10-5);其與3-4度粒細(xì)胞減少相關(guān)性

18、在非吸煙者(校正OR=16.38,95％CI=5.88-45.61,P=8.84×10-8),女性(校正OR=12.87,95％CI=3.70-44.76,P=5.92×10-5)亞組人群中更顯著。進(jìn)一步基因.環(huán)境交互分析表明,IL-1 b rs16944基因型,rs1143627基因型與吸煙狀態(tài)、性別因素在對(duì)白細(xì)胞減少、粒細(xì)胞減少發(fā)生的影響中呈現(xiàn)顯著的交互作用。在粒細(xì)胞減少不良反應(yīng)中,rs16944基因型-吸煙,rs16944基因型-

19、性別交互作用P值分別為0.001,0.007。
　　攜帶XPC rs222800 T/T基因型個(gè)體生存期低于攜帶C/C+C/T基因型個(gè)體(MST,14個(gè)月v18個(gè)月),攜帶Rad52 rs1051669 A/A基因型個(gè)體生存期低于攜帶野生型G/G+A/G個(gè)體(MST,7個(gè)月v18個(gè)月),差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　本研究首次從整體上探索了DNA損傷修復(fù)通路,葉酸代謝通路及炎癥通路基因多態(tài)和肺癌化療療效,不良反應(yīng)及總生存期的關(guān)系