in vitro pull down

1、PullDownPullDown技術(shù)是通過蛋白相互作用來研究細(xì)胞通路的有力工具。PullDown實(shí)驗(yàn)是確定兩種或更多蛋白之間相互作用的體外方法。PullDown實(shí)驗(yàn)可用來檢測已知蛋白的表達(dá)和相互作用條件，并且可用來篩選未知的蛋白相互作用。PullDown實(shí)驗(yàn)至少需要一種純化的標(biāo)簽蛋白（誘餌）用來捕獲和“pulldown”靶蛋白（獵物）。PullDownPullDownvs.vs.免疫沉淀免疫沉淀PullDown實(shí)驗(yàn)是親和純化的一種形式，

2、其與免疫沉淀十分類似，不同之處在于使用誘餌蛋白代替了抗體。在PullDown實(shí)驗(yàn)中，帶有標(biāo)簽的誘餌蛋白被特異結(jié)合該標(biāo)簽的固相化親和配基捕獲，產(chǎn)生“次級親和支持物”，用于純化與誘餌蛋白相互作用的其他蛋白。含有固相化誘餌蛋白的次級親和支持物可以與含有推測獵物蛋白的各種蛋白樣品相互孵育。如果緩沖液及樣品條件與靶結(jié)合相互作用兼容，且誘餌蛋白在帶有標(biāo)簽和被固相化時(shí)仍然可以行使功能，那么存在于樣品中的獵物蛋白就會(huì)結(jié)合到親和支持物上。如果特異結(jié)合相互

3、作用的親和性足夠強(qiáng)，那么非結(jié)合的樣品成分可以被洗滌掉，進(jìn)而純化形式的獵物或誘餌獵物復(fù)合體可被從支持物上洗脫下來。誘餌蛋白固相化策略誘餌蛋白固相化策略1.依賴固相化抗體結(jié)合蛋白（例如蛋白A或蛋白G瓊脂糖）的免疫沉淀形式顯然對pulldown實(shí)驗(yàn)不是很有效。必須使用其他親和系統(tǒng)固相化誘餌蛋白（例如‘baitthehook’）。如果有純化的天然的誘餌蛋白，可將其用生物素進(jìn)行標(biāo)記或偶聯(lián)一些其他小的標(biāo)簽，以適用于現(xiàn)成的親和樹脂。即用型生物素化試劑

4、及標(biāo)記試劑盒（見目錄第九節(jié)，281頁），可實(shí)現(xiàn)使用鏈親和素瓊脂糖樹脂進(jìn)行pulldown實(shí)驗(yàn)。2.如果被用作誘餌的蛋白是重組蛋白，那么其很可能會(huì)含有一個(gè)用于純化的親和標(biāo)簽。這個(gè)融合標(biāo)簽就會(huì)成為該誘餌蛋白用于pulldown實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。最常見的標(biāo)簽為谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）和多組氨酸（6His），其分別使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金屬螯合物親和配體。接下來的試劑盒被優(yōu)化用于這些特別的親和系統(tǒng)。列于下面幾頁中的ThermoScienti

5、ficGTPasePullDown和檢測試劑盒，使用含有GST標(biāo)簽的特異GTPase蛋白的下游效應(yīng)子進(jìn)行檢測。一、生物素標(biāo)記一、生物素標(biāo)記PullDownPullDown實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)者須提供生物素化蛋白作為“誘餌”和表達(dá)互作靶標(biāo)推測蛋白（“獵物”）的細(xì)胞。親和體系是已知且特異的生物素鏈親和素的相互作用。生物素化蛋白作為“誘餌”捕獲推測的連接配體（即“獵物”）。在一個(gè)典型的pulldown實(shí)驗(yàn)中，被固定的誘餌蛋白在細(xì)胞裂解液中孵育。經(jīng)過指

6、定步驟的漂洗后，“反應(yīng)物”被選擇性洗脫以進(jìn)行凝膠分析或Western印跡。因?yàn)樯锼劓溣H素和的互作連接親和度較高，一般情況下獵物蛋白被洗脫掉，而生物素化誘餌蛋白則仍保持固定在鏈親和素瓊脂糖樹脂上，不被洗脫。鏈親和素瓊脂糖樹脂鏈親和素瓊脂糖樹脂三、多組氨酸三、多組氨酸PullDownPullDown實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用于捕獲及純化與多組氨酸標(biāo)簽融合蛋白發(fā)生相互作用的蛋白。實(shí)驗(yàn)者需提供含有標(biāo)簽的融合蛋白（誘餌）及表達(dá)推測蛋白相互作用靶蛋白（獵物）的細(xì)