利用GST pull-down方法篩查PAD4相互作用蛋白的初步研究.pdf

1、GST pull-down法作為蛋白質(zhì)相互作用的體外研究方法之一，簡單、方便、易操作，但研究未知的蛋白質(zhì)相互作用難度較大，少有報(bào)道;肽?；彼崦搧啺访?(Peptidyl Arginine Deiminase typeⅣ, PAD4)作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RheumatoidArthritis，RA)易感基因，其介導(dǎo)的組蛋白瓜氨酸化是哺乳類固有免疫-中性粒細(xì)胞胞外陷阱(Neutrophil Extracellular Traps，NET

2、)形成的必要條件。PAD4也可以作為共抑制因子下調(diào)抗癌基因P53誘導(dǎo)的下游基因的表達(dá)，被認(rèn)為參與了腫瘤的發(fā)生，但具體作用機(jī)制尚不清楚;PAD4主要在免疫細(xì)胞中表達(dá)，是五種肽?；彼崦搧啺访钢形ㄒ痪哂泻硕ㄎ恍盘?hào)的蛋白多肽瓜氨酸化酶。實(shí)驗(yàn)室通過蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn)TNF-α有誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞中PAD4蛋白核轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，PAD4蛋白核轉(zhuǎn)移后分子量變大，推測入核過程中可能與其他蛋白發(fā)生相互作用。明確其核轉(zhuǎn)移時(shí)相互作用蛋白及闡明其核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，對于認(rèn)

3、識(shí)PAD4在正常生理狀態(tài)和病變情況下的基因功能具有重要的意義，實(shí)驗(yàn)室選取HL-60細(xì)胞，利用GST pull-down assay在這方面進(jìn)行了初步探索。
　　目的:構(gòu)建GST-PAD4載體及核定位信號(hào)缺失載體GST-PAD4-NLS-，通過優(yōu)化表達(dá)條件得到高純度融合蛋白GST-PAD4及GST-PAD4-NLS-，用GST pull-down assay初步尋找PAD4核轉(zhuǎn)移時(shí)與之相互作用的蛋白。
　　方法:用TNF-α處

4、理HL-60細(xì)胞，蛋白免疫印跡觀察PAD4在HL-60細(xì)胞中核轉(zhuǎn)移，然后構(gòu)建帶有GST標(biāo)簽的PAD4以及PAD4核定位信號(hào)缺失(PAD4-NLS-)的原核表達(dá)載體;通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，獲得重組蛋白表達(dá)的工程菌，經(jīng)過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，獲得重組蛋白的可溶性表達(dá);再利用Sepharose4B親和層析法分別純化出重組蛋白GST-PAD4以及GST-PAD4-NLS-，將純化的重組蛋白分別固定在谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Sepharose4B

5、)上，與來源于HL-60細(xì)胞中的總蛋白共同孵育，富集可能與GST-PAD4以及GST-PAD4-NLS-發(fā)生相互作用的蛋白;最后經(jīng)SDS-PAGE聯(lián)合銀染初步尋找可能與PAD4或PAD4-NLS-發(fā)生相互作用的蛋白。
　　結(jié)果:蛋白免疫觀印跡察到TNF-α有誘導(dǎo)PAD4在HL-60細(xì)胞中核轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，PAD4入核后分子量變大，TNF-α誘導(dǎo)2h左右PAD4入核現(xiàn)象明顯;優(yōu)化獲得融合蛋白GST-PAD4最佳可溶性表達(dá)條件:16℃下菌液

6、OD600約為0.4時(shí)加入0.1mM IPTG誘導(dǎo)12h以上，在這一條件下獲得高純度的融合蛋白GST-PAD4以及GST-PAD4-NLS-;利用GST pull-down方法捕獲到PAD4核轉(zhuǎn)移時(shí)可能與之相互作用的蛋白并利用SDS-PAGE聯(lián)合銀染的方法進(jìn)行了初步分析。
　　結(jié)論:觀察到TNF-α誘導(dǎo)PAD4核轉(zhuǎn)移后有分子量增加的現(xiàn)象;通過優(yōu)化表達(dá)條件可以獲得高純度的融合蛋白;利用GST pull-down方法初步篩查到一條與P