兩種定量分析方法的比較及taqman探針引物設(shè)計(jì)原則

1、兩種定量分析方法的比較及Taqman探針、引物設(shè)計(jì)原則遺傳物質(zhì)DNA首先要把所攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)錄成為信使RNA（mRNA）攜帶遺傳信息的mRNA從細(xì)胞核進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中與核糖體結(jié)合，在核糖體中mRNA攜帶的遺傳信息被翻譯成為多肽，多肽經(jīng)過進(jìn)一步加工后變成蛋白質(zhì)，至此遺傳物質(zhì)DNA完成了表達(dá)過程。期間的轉(zhuǎn)錄過程是基因表達(dá)中非常重要的調(diào)節(jié)步驟，所轉(zhuǎn)錄的mRNA的多少直接影響著相關(guān)最終蛋白質(zhì)的多少，所以通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)某條基因mRNA含量多少的分析

2、，就能大致判斷出該條基因的表達(dá)是否活躍。定量PCR儀是在普通PCR儀的基礎(chǔ)上加裝了熒光激發(fā)裝置和熒光檢測(cè)裝置，PCR擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行；在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。該技術(shù)于1996年由美國(guó)AppliedBiosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高

3、等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。定量定量PCR常用的三個(gè)常用概念常用的三個(gè)常用概念擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值擴(kuò)增曲線：反映PCR循環(huán)次數(shù)和熒光強(qiáng)度的曲線，定量PCR儀每次輪PCR擴(kuò)增都會(huì)自動(dòng)記錄熒光強(qiáng)度的變化熒光閾值：樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值，手動(dòng)設(shè)置的原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99。CT值：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)

4、過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。擴(kuò)增曲線閾值及CT值熒光定量光定量PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理理想的PCR反應(yīng)：X=X02n非理想的PCR反應(yīng)：X=X0(1Ex)n（n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)；X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量；X0：初始模板量；Ex：擴(kuò)增效率）C(t)value段的目的基因的量和內(nèi)參基因的量相除，得出一個(gè)比值；最后再將不同生理階段所得的比值相除，最終得出目的基因在不同生理階段的表達(dá)變化。公式如下：雙標(biāo)準(zhǔn)曲準(zhǔn)曲線法的特點(diǎn)：法的特點(diǎn)：1考慮到了不同基

5、因擴(kuò)增效率的差異，用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)校正擴(kuò)增效率，最大限度的避免了誤差；2思路直觀、條理清晰、應(yīng)用簡(jiǎn)便，無(wú)需像DeltadeltaCT法那樣對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行嚴(yán)格的優(yōu)化；3其不足之處是每次實(shí)驗(yàn)都必需對(duì)目的基因和看家基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線；4該方法適合樣品量大，但是所分析目的基因較少的實(shí)驗(yàn)。二、二、2△△△△CT法公式如下：1、2△△△△CT方法的推方法的推導(dǎo)PCR指數(shù)擴(kuò)增的公式是：Xn是第n個(gè)循環(huán)后目標(biāo)分子數(shù)；X0是初始目標(biāo)分子數(shù)；Ex是目標(biāo)分子擴(kuò)增效率；n