藥物定量分析與分析方法驗證ppt課件

1、第五章 體內(nèi)藥物分析,體內(nèi)藥物分析是一門研究生物機體中藥物及其代謝物和內(nèi)源性物質(zhì)的質(zhì)與量變化規(guī)律的分析方法學 體內(nèi)藥物分析又被稱為 生物醫(yī)藥分析 Biomedical Analysis 生物藥物分析 Biopharmaceutical Analysis,,——藥物分析的重要分支學科——研究生物機體中外源性藥物及其代謝物和內(nèi)源性活性物質(zhì)的質(zhì)與量的變化規(guī)律——藥物的體內(nèi)研究和治療藥物監(jiān)測——綜合性較強的應用學科:分析方

2、法學——為將來的相關課程（臨床藥學、臨床藥理學、生物藥劑學）學習和實驗研究奠定重要的基礎,藥物進入體內(nèi)后——經(jīng)過吸收、分布、代謝和排泄等動力學過程——化學結(jié)構(gòu)和存在狀態(tài)都可能發(fā)生變化——在不同個體中存在差異（個體差異）——進而直接影響到藥物在不同個體中的治療效應和毒副作用——需對生物體內(nèi)藥物及其代謝物進行研究分析,藥物在人（或動物）體內(nèi)的存在形式 游離型:原形藥物或代謝物 藥物或其代謝物與葡萄糖醛酸等結(jié)

3、合:綴合物 藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合:結(jié)合物體內(nèi)藥物分析的任務 檢測人（或動物）的體液或組織（生物樣本）中的藥物或特定代謝物的濃度,生物樣本的特點 1.藥物濃度：低，要求方法靈敏度高 2.干擾物質(zhì)：多，要求方法專屬性好 3.樣品量少、不能重復取樣.生物樣品多數(shù)在特定條件下采集，無法再次取樣，且濃度低、變化幅度大. 在樣品測定之前，進行適當?shù)臉悠分苽?，進行分離、純化、濃集、必要時還需對待測組

4、分進行化學衍生化，然后進行測定,,評價藥物的安全性（臨床前研究）：動物 評價藥物的有效性（臨床研究）：人體（健康志愿者或患者） 用藥的安全、有效與合理：人體（患者TDM :治療藥物血濃度監(jiān)測 ）,,分析方法有: ①色譜法:HPLC,HPCE,GC ②光譜法:比色法、紫外-可見分光光度法、熒光分光光度法、原子吸收分光光度法 ③免疫分析法:放射免疫法RIA、酶免疫法EIA、化學發(fā)光酶免

5、疫、熒光免疫分析 ④聯(lián)用技術:GC-MS、LC-MS、LC-NMR,發(fā)展概況,20世紀60年代:臨床藥理學與生物藥劑學建立 70年代初:體內(nèi)藥物分析在國外開始建立 70年代末:血藥濃度監(jiān)測廣泛用于臨床 80年代:體內(nèi)藥物分析學科雛形基本形成 國內(nèi)發(fā)展概況：在70年代末受到關注1979年有相關論文發(fā)表 1981年在“中國藥學會藥物分析第一次學術會議”大會上作學術報告，引起了廣泛的關注

6、和興趣80年代中期，許多高等醫(yī)藥院校為本科生、碩士研究生開設了體內(nèi)藥物分析必修和選修課程.,學科主要研究問題,游離型血藥濃度測定方法研究 血中游離型藥物濃度(F)與總濃度(T)的比率(F/T)及唾液與血液游離濃度的比率(S/P)以及它們之間的相關性的研究 代謝物的監(jiān)測與研究 對映體的監(jiān)測與研究 體內(nèi)微量元素的測定與研究 方便、快捷的樣品制備方法與樣品直接進樣分析的研究

7、分析新方法、新技術的聯(lián)用研究 體內(nèi)藥物分析方法的質(zhì)量控制研究,第一節(jié) 常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏一. 樣品種類，采集與制備,1.血樣：血藥濃度一般指血漿（血清中）藥物濃度，它可正確反映藥物在作用點的濃度。 藥物在血中分布均勻后取樣：a.動物：動脈或心臟，b.人靜脈或毛細管采血. 血液：a.加抗凝劑混合（EDTA,肝素etc),離心(3000r/min ，5min)取上清液為血漿。b.室溫放0.5~1h，3000 r/

8、min離心5~10 min ,取上清液為血清。C.全血.,,,要點：取樣后及時分離出血漿（清），隨后進行分析，若不能馬上測定，應密塞后置冰箱保存（時間短：4℃，長：-20℃) 應用:藥物動力學;生物利用度;臨床治療藥物監(jiān)測(TDM),,2·尿液 優(yōu)點：易收集、量大，主要用于藥物劑量回收，尿清除率，生物利用度研究，以及藥物代謝研究，一般采集24h尿液，最好立即測定，否則要加防腐劑（PhCH3,CHCl3e

9、tc）置冰箱保存。 缺點：尿液中藥濃度與血藥濃度相關性差，腎功能不全者不適于取樣 3·唾液： 優(yōu)點：樣品易得，采集無痛，無危險。 缺點：一般唾液中藥濃與血藥濃度不吻合，易變,,,4.組織：用于藥物體內(nèi)動力學研究 步驟：取樣，勻漿，去蛋白 5.頭發(fā)：主要用于體內(nèi)微量元素的測定。 枕部取樣，洗凈，消化或者高溫灰化后測定,,二 體內(nèi)樣品的貯藏與處理 1.

10、冷藏或冷凍 2.去活性：快速冷凍；微波照射；加入酶活性阻斷劑或者抗氧劑；高溫煮沸。,第二節(jié).體內(nèi)樣品分析的前處理,依據(jù): 1）樣品種類（血，尿） 2）被測藥物結(jié)構(gòu)及性質(zhì) 3）測定方法：專屬性，LOD 應用： 1.藥物含量高，處理簡單。 2.樣品干擾小,(如尿）,前處理簡單 3.測定方法專屬性好(HPLC),前處理簡單。,,,一. 目的 1.使待測藥物游離 2.滿足測定方

11、法的要求:重點考慮分析方法的靈敏度和專屬性. 3.改善分析環(huán)境:如HPLC.,二.樣品前處理方法·1.去除蛋白質(zhì),目的：①使結(jié)合型藥物釋放出來 ②減少乳化 ③保護色譜柱 方法： 1）加入與水相混溶的有機溶劑（EtOH,Me2CO, CH3CN, etc）,混勻后離心，取上清液分析（破壞氫鍵使蛋白質(zhì)凝聚）. 2）加中性鹽[Na2SO4,(NH4)2SO4 ]

12、：與水結(jié)合，使蛋白質(zhì)脫水而沉淀，離心后取上清液。,,3）加強酸（CCl3COOH,HClO4）,適于pH＜PI,蛋白質(zhì)為陽離子,與強酸形成不溶性鹽而沉淀。 4）加鋅或銅鹽的沉淀劑如CuSO4-Na2WO4, ZnSO4 –NaOH,適于pH＞PI,蛋白質(zhì)為陰離子，與金屬陽離子形成不溶鹽而沉淀 5）酶解法：用枯草菌溶素使肽鏈降解，50~60 ℃具最大活力，條件溫和，作用強，適于酸不穩(wěn)定及結(jié)合牢固的藥物. 6)

13、熱凝固法,,,樣品前處理· 2.分離，純化，濃集,目的：消除干擾，使待測物以適合的形式和量用于分析。 (1)液-液提?。↙LE） ①藥物親脂性強 ②內(nèi)源性雜質(zhì)親水性強 采用有機溶劑提取后可大大純化樣品,,1）有機溶劑(極性見表5-1)：要求對待側(cè)組分S大，bp低，水溶性小，無毒，穩(wěn)定，不易乳化。常用Et2O,CHCl3 2）二相體積比：采用少量多次提取法。 3）水相p

14、H值：主要考慮藥物的酸堿性 如：選擇水相pH為堿性,藥物是生物堿內(nèi)源性雜質(zhì)為酸性,游離堿 脂液成鹽 水溶性增加,,,,（2) 固相萃?。⊿olid-phase Extraction,SPE） 小型柱色譜，填料粒度小，分離效能高，無乳化現(xiàn)象，處理樣品速度快，常用提?。?a.親水性用硅藻土；b.疏水性用C18.由Varian公司生產(chǎn)的半自動樣品制備系統(tǒng)（Advanced aut

15、omated sample processor, AASP)使SPE更簡便，快速，樣品經(jīng)10個固定微型柱離線萃取，微柱轉(zhuǎn)移到自動進樣器做預柱，由流動相將分析物洗脫至分析柱。 缺點：成本高,,,,(3)超濾:一種膜分離技術,按照分子量大小,分離水溶性生物大分子.,3.綴合物水解,含極性基團（OH,NH2,COOH）的藥物，常與內(nèi)源性物質(zhì)（如葡萄糖醛酸）形成綴合物，當測定尿液中藥物濃度時，需將綴合物中藥物釋出，常用酸解或酶解的方法

16、。,,4.化學衍生,目的：1）提高檢測靈敏度，如HPLC紫外檢測2）增加藥物穩(wěn)定性。3）提高藥物分析能力，如： a.GC中的-COOH衍生成-COOCH3增大揮發(fā) 性，減少極性。 b.手性分離中：生成非光學異構(gòu)體（普通柱色譜分析）,,1）GC: R—COOH Ar-OH,,CH2N2 CH3OH,RCOOCH3RCOOSiMe3,,,ArOCOCH3Ar-O-CH3 Ar-OSiMe3

17、,,2）手性分離： +（R）-E,,R-SA S-SA手性藥物,（R）E-（R）SA（R）E-（S）SA,,光活性試劑,非對映異構(gòu)體,,3）HPLC:如慶大霉素C組分檢查 a.柱前衍生 b.柱后衍生，需一個額外的泵,,,第三節(jié) 定量分析方法驗證·,一 分析方法的建立 1.分析方法:色譜分析法;免疫分析法;生物學方法. 2.步驟:(

18、1)色譜條件選擇,(2)色譜條件優(yōu)化:空白溶劑試驗→考查溶劑影響;空白生物基質(zhì)試驗→考查生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的影響(方法特異性); 質(zhì)控生物樣品試驗（空白生物基質(zhì)中加入待測藥物）→考查方法效能指標;(3)實際樣品(Incurre samples)測試→代謝產(chǎn)物的干擾(方法特異性),,二 分析方法驗證(validation) 用于實際生物樣品分析之前驗證分析方法的可行性與可靠性,（一）方法特異性specificity(專屬

19、性或選擇性selectivity),系指當有內(nèi)源性物質(zhì)存在時，方法準確測定待測物質(zhì)的能力專屬性：表示所檢測的信號(響應)系屬于待測藥物所特有的能力。選擇性：系指將待測物質(zhì)與其代謝物及同服的其它藥物加以區(qū)分(分離)的能力。特異性：函蓋二者，以驗證所測定的物質(zhì)與待測藥物的同一性。,1. 內(nèi)源性物質(zhì)的干擾,考查待測藥物或其活性代謝產(chǎn)物檢測信號 比較對照品（或標準品），空白生物基質(zhì)，模擬生物樣品（空白生物基中加對照品

20、）信號。如HPLC色譜峰的tR、n和T是否一致， 及與內(nèi)源性物質(zhì)色譜峰的R 確證：內(nèi)源性物質(zhì)對分析方法有無干擾,2. 代謝產(chǎn)物的干擾,比較模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣品的檢測信號與代謝產(chǎn)物的R值。確證：其它代謝產(chǎn)物對分析方法有無干擾 結(jié)構(gòu)已知的特定活性代謝物的測定必要時通過HPLC-DAD或LC-MS確證色譜峰的單純性和同一性 對于結(jié)構(gòu)未知的代謝產(chǎn)物的測定，可采用LC-LC-NM

21、R進行結(jié)構(gòu)的初步推測后，考察其干擾情況。,3. 伍用藥物的干擾,進行TDM時，還要考慮患者可能同時服用藥物(通常為數(shù)有限)的干擾。 比較待測藥物及可能同時服用藥物的模擬生物樣品的檢測信號確證：同時服用藥物對分析方法的干擾情況,4. 與參比方法的相關性,參比方法一般選用特異性強、準確度高、線性關系良好的色譜法 如在TDM中使用UV(或RIA)時, 可以用HPLC(或GC)為參比；以參比方法測定結(jié)果為橫坐標(X);

22、 擬定方法測定結(jié)果為縱坐標(Y)用最小二乘法計算回歸方程 Y＝a＋bX (坐標標度相等)和相關系數(shù)(r)——表示兩種方法測得結(jié)果的一致性。,Y＝a＋bX 截距(a)：表示擬定方法受到恒定干擾的程度：內(nèi)源性物質(zhì)(UV) 斜率(b)：表示擬定方法受到比例干擾的程度：標記抗原不純(RIA) 與參比方法的相關性比較:除顯示分析方法的特異性外,斜率b表示兩種方法測得結(jié)果的一致性 若截距a≈0, 則擬定

23、方法的準確度(回收率)為100b(%),,（二）標準曲線和定量范圍,標準曲線(standard curve)，or叫校正曲線(calibration curve)，or working curve生物樣品中所測定藥物濃度與響應的相關性 通常用回歸分析方法所得的回歸方程來評價除少數(shù)方法（免疫分析法）

24、外，標準曲線通常為線性模式回歸分析法為最小二乘法（least squares）或加權(quán)最小二乘法（weighted least squares1·使用與待測樣品相同的生物介質(zhì)。2·標準曲線點數(shù)≥6，線性范圍包含全部待測濃度。,,,3.標準曲線的高低濃度范圍叫定量（線性）范圍（quantification range），應能覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度 4.以待測藥物的檢測響應(如色譜峰面積或峰高)

25、 或與內(nèi)標物質(zhì)的檢測響應的比值(內(nèi)標法)(因變量,y)對標準樣品中藥物濃度(自變量,x)，進行線性回歸，求得回歸方程(y＝a＋bx)及其相關系數(shù)( ? )，最高濃度應高于達峰濃度(Cmax)；最低濃度應低于Cmax的10%～5%，并應為方法的LOQ，回歸方程的截距應接近于零，相關系數(shù)要求 ?≥0.99(色譜法)或≥0.98(生物學方法),5.標準系列模擬生物樣品的制備,空白生物基質(zhì)(如血漿)——加入標準系列溶液適量，渦旋混勻，防止在標準

26、溶液加入及渦旋混合時造成損失 ①先加入標準溶液 ②再加入空白生物基質(zhì) ③渦旋混勻,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,（三）定量下限（LLOQ） 標準曲線上的最低濃度點，表示方法的靈敏度（sensitivity），即測定樣品中符合準確度和精密度要求的最低藥物濃度。 應能滿足測定3～5個消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度 準確度在80%～120%(或RE在±20%

27、的范圍內(nèi))RSD應＜20%,,（四）精密度precision與準確度accuracy 高中低三個濃度的QC樣品，LOQ附近，標準曲線上限及中間各一個濃度各5個樣。 日內(nèi)，日間精密度的RSD＜15%，LOQ附近20%，加樣回收率85~115%,LOQ附近80~120%。,準確度以測定值M (measured)的平均值與理論濃度(加入值)A(added)的比值表示相對回收率相對誤差 限度要求:相

28、對回收率應在85%～115% (LOQ附近80%～120%),RE在±15% (LOQ附近為±20%),方法精密度一般用標準偏差(standard deviation，SD)或相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)表示 SD=RSD= = 包括批內(nèi)(within-run或intra-assay)RSD(日內(nèi)) 和批間(between

29、-run或inter-assay)RSD(日間),,,方差分析法 批間RSD =批內(nèi)RSD ==,,SSe：批內(nèi)方差；SSA：批間方差；SStot：總方差；Xij：第i批第j次測定；Xi.:第i批n次測定平均值; X:N次測定總平均值;I:測定批數(shù);n:每批測定次數(shù);N:總測定次數(shù),,,(五）樣品穩(wěn)定性 室溫及冷凍下，測A（吸收度或峰面積）以考察不同條件下，樣品的可保存時間及穩(wěn)定性 QC樣

30、品穿插于實際樣品測定全過程模擬(或?qū)嶋H)生物樣品及其預處理后的待測溶液進行考察 要求：準確度85%～115%(RE在±15%范圍內(nèi))，RSD＜15%,,,（六）提取回收率（extraction recovery）,考察樣品處理過程的回收率 重現(xiàn)性好 提取回收率一般應≥50%高、中濃度的RSD應≤15%低濃度的RSD應≤20%。,,,取空白生物基質(zhì)(如血漿)，照準確度項下方法，制備高、中、低

31、3個濃度的QC樣品(每一濃度至少5個樣品)，每個樣品分析測定1次另取等量的相同3個濃度的標準溶液，用空白生物介質(zhì)稀釋至同體積，同法測定 AT：經(jīng)提取后的QC樣品的檢測信號或比值(內(nèi)標法)AS：未經(jīng)提取的標準溶液的檢測信號或比值(內(nèi)標法),,,（七）質(zhì)量控制,整個分析過程要遵從預先制定的實驗室操作規(guī)范（Standard Operating Procedures,SOP)以及GLP原則。,,,（八）實際樣品濃度

32、超出定量范圍的處理 （九）名詞解釋 1.標準物質(zhì)（reference standard）：用于制備標準樣品和QC樣品。 2.生物介質(zhì)（biological matrix） 3.介質(zhì)效應（matrix effect） 4.標準樣品（standard sample）：用于建立標準曲線。 5.質(zhì)控樣品（quality control sample）：用于監(jiān)測和評價分析方法的效能和結(jié)果的可靠性。,,6.質(zhì)控樣品池（pool