細(xì)菌內(nèi)毒素定量分析概要

1、2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,1,細(xì)菌內(nèi)毒素光度測定法試驗(yàn)講義講解 董光宴 1、光度測定法概述 2、試劑和儀器 3、標(biāo)準(zhǔn)曲線 4、干擾試驗(yàn) 5、檢查法 湛江博康海洋生物有限公司,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,2,一、光度測定法概述1、定量法的概念2、定量法的分類3、定量法的原

2、理,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,3,1 定量法的概念 光度測定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法： 濁度法系利用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化而測定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測原理，可分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測濁度增加速度的方法。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,4,2 定量法分類,20

3、24年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,5,3 定量法的原理（1）動(dòng)力學(xué)曲線：細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)過程中，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，混合物會逐漸變混濁，內(nèi)毒素濃度越高濁度變化越快，濁度變化符合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,6,（2）細(xì)菌內(nèi)毒素含量與時(shí)間的關(guān)系：細(xì)菌內(nèi)毒素濃度與反應(yīng)時(shí)間分別取對數(shù)后，將兩組數(shù)據(jù)用最小二乘法統(tǒng)計(jì)，可以得到直線：LgT=a+bLgC 我們將這條直

4、線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,7,（3）、數(shù)學(xué)原理 原理：OD=-Lg（It/Io） 0.02=-Lg（It/Io） It=95%Io,2024年2月25日星期日,8,博康www.zj-hy.com,二 試劑和儀器光度測定法鱟試劑（生產(chǎn)單位：湛江博康海洋生物有限公司，批號：0907104，檢測限：0.015EU/ml；規(guī)格為1.25ml/

5、支）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（生產(chǎn)單位：湛江博康海洋生物有限公司，批號：0908030，規(guī)格：2ml/支）,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,9,細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（200966，120EU/支，中國藥品生物制品檢定所提供）氯化鉀注射液（規(guī)格：1g/10ml 批號：0911211，生產(chǎn)廠家：河北某制藥廠） 細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測儀（生產(chǎn)單位：天大天發(fā)科技有限，型號：BET-72）,2024年2月25日星期日,博

6、康www.zj-hy.com,10,三 標(biāo)準(zhǔn)曲線1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的選擇3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作4、標(biāo)準(zhǔn)曲線有效的條件5、結(jié)果分析,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,11,1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能會影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)。用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素配成溶液，并制成至少3個(gè)濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10），最低濃度不得低于

7、所用鱟試劑的標(biāo)示檢測限。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,12,2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的選擇 制做標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)毒素濃度可選擇10倍、5倍、4倍和2倍稀釋的等比系列點(diǎn)，也可選擇非等比系列點(diǎn)。一般情況下，我們不推薦10倍和2倍等比系列點(diǎn)，10倍等比系列點(diǎn)（如10EU/ml、1EU/ml、0.1EU/ml和0.01EU/ml）跨度大，其相關(guān)系數(shù)R和準(zhǔn)確性都受到一定限制；,2024年2月25日星期日,博康www.zj-h

8、y.com,13,2倍等比系列點(diǎn)（如0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.06EU/ml）跨度太小，其相關(guān)系數(shù)R和準(zhǔn)確性都較好，但很不實(shí)用。我們推薦選用4倍等比系列點(diǎn)（如2EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml）跨度適中，其相關(guān)系數(shù)R和準(zhǔn)確性都較好，而且非常實(shí)用。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,14,3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作3.1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的溶解稀釋

9、 首先將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水1ml溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制備成2EU/ml、1EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml備用。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,15,200EU/ml,20EU/ml,2.0EU/ml,1.0EU/ml,0.5EU/ml,0.03EU/ml,0.125EU/ml,,0.3ml,,0.3ml,2.7ml,2.7

10、ml,,,,,1.5ml,1.5ml,1.5ml,1.5ml,1.5ml,1.5ml,0.5ml,0.5ml,圖 示,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,16,3.2 定量法鱟試劑的溶解分裝 將復(fù)溶好的光度測定法鱟試劑分裝到14支定量分析專用試管中，每管分裝0.1ml。,,定量法鱟試劑,定量試管每管0.1ml,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,17,3.3 加 樣

11、將內(nèi)毒素加入定量分析專用試管中，每個(gè)濃度做3支平行管，剩下兩管加入BET水作為陰性對照，每管加樣量均為0.2ml 。,2EU/ml,0.5EU/ml,0.125EU/ml,0.03EU/ml,BET水,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,18,注：產(chǎn)品名稱：有機(jī)玻璃試管架 用    途：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查定量法中用于擺放小試管。 特    點(diǎn)：有機(jī)玻璃材

12、料可保護(hù)定量法小試管，避免定量法小試管被磨花而影響試驗(yàn)結(jié)果。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,19,3.4 檢 測 加樣完畢后用封口膜密封試管，將每支試管在旋渦混合器上點(diǎn)1-3秒，然后將試管對應(yīng)插入已恒溫的定量檢測儀（37℃），儀器開始自動(dòng)采集數(shù)據(jù)。注：封口膜的優(yōu)點(diǎn)規(guī)   格：4IN×35FT（4英寸×35英尺）特   點(diǎn)：進(jìn)口代銷

13、，比較適合用于定量法專用試管的封口，清洗時(shí)不留任何殘留物。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,20,4 標(biāo)準(zhǔn)曲線有效的條件當(dāng)陰性對照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。根據(jù)線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）的絕對值應(yīng)該大于或等于0.980，試驗(yàn)方為有效。平行管的變異系數(shù)＜10%。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,21,5 結(jié)果分析,,標(biāo)準(zhǔn)曲

14、線：LogT=2.9783-0.2621LogC，相關(guān)系數(shù)：?=-0.9999,標(biāo)準(zhǔn)曲線符合規(guī)定。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,22,四 干擾試驗(yàn)1、限值的確定2、干擾試驗(yàn)濃度的計(jì)算3、檢測濃度的選擇4、干擾試驗(yàn)溶液的制備5、供試品溶液的稀釋6、干擾試驗(yàn)的制備方法7、干擾試驗(yàn)加樣 8、判斷的標(biāo)準(zhǔn)9、試驗(yàn)結(jié)果分析 10、結(jié) 論,2024年2月25日星期日,博康www.zj-

15、hy.com,23,1 限值的確定 2010版《中國藥典》二部正文1014頁【氯化鉀注射液】。L=0.12EU/mg,2024年2月25日星期日,24,博康www.zj-hy.com,2 干擾試驗(yàn)濃度的計(jì)算 按照中國藥典2010年版提供的公式計(jì)算最大有效稀釋倍數(shù)（注：其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)λ為0.015EU/ml）。 最大有效稀釋倍數(shù)： MVD= CL/λ =100Х 0

16、.12/0.015 =800倍,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,25,3 檢測濃度的選擇 樣品限值表達(dá)方式為EU/ml，直接選用其無干擾濃度并填寫相應(yīng)稀釋倍數(shù)即可；樣品限值表達(dá)方式為EU/mg ，無論其干擾情況如何，我們推薦以1mg/ml為初始濃度，選用其以下的無干擾濃度并填寫從1mg/ml開始的相應(yīng)稀釋倍數(shù)，這樣檢測結(jié)果即為樣品每ml或mg中內(nèi)毒素的量。 我們將檢測結(jié)果直接與限值

17、比較即可。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,26,4 干擾試驗(yàn)溶液的制備,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,27,5 供試品溶液的稀釋 用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將氯化鉀注射液稀釋到2.0mg/ml、1.0mg/ml和0.5mg/ml備用。操作過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，保證無外源物質(zhì)的干擾。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,28,10.0mg/ml,2

18、.0mg/ml,1.0mg/ml,0.5mg/ml,0.3ml,2.7ml,1.0ml,1.0ml,0.3ml,4.0ml,1.0ml,0.3ml,,,,,100mg/ml,圖 示,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,29,6 干擾試驗(yàn)的制備方法 取氯化鉀注射液的2.0mg/ml 、1.0mg/ml稀釋液分別加入四支試管中，每管加0.3ml，然后分別吸取0.3ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為1.0EU/

19、ml按下圖加入其中兩支試管中，另外吸取0.3ml的檢查用水加入其中另外兩支試管中。將這四支管混合均勻即可得到氯化鉀注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀釋液干擾試驗(yàn)所需樣品溶液。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,30,,,氯化鉀注射液,內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0EU/ml,0.3ml,0.3ml,0.3ml(2.0mg/ml),0.3ml(2.0mg/ml),0.3ml(1.0mg/ml),0.3m

20、l(1.0mg/ml),,,,,BET水,,,0.3ml,0.3ml,圖 示,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,31,7 干擾試驗(yàn)加樣 取分裝了0.1ml定量法鱟試劑的定量專用試管10支，每個(gè)濃度做2支平行管，氯化鉀注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀釋液干擾試驗(yàn)各4支；另做2支陰性對照，每管加樣量均為0.2ml。加樣完畢后密封試管，將每支試管在旋渦混合器上點(diǎn)1-3秒，然后對應(yīng)插入定量檢

21、測儀，儀器開始采集數(shù)據(jù)。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,32,0.1ml鱟試劑,0.1ml鱟試劑,0.1ml鱟試劑,1mg/ml的加樣,0.2ml,0.2ml,0.5mg/ml的加樣,0.2ml,陰性對照,圖 示,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,33,8 判斷的標(biāo)準(zhǔn) 按所得線性回歸方程分別計(jì)算供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量Ct和Cs，再按下式計(jì)算該

22、試驗(yàn)條件下的回收率（R）。 R=(CS-Ct)/λm×100%當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在50%-200%之間，則認(rèn)為在此該試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,34,圖 示,回收率： R=(CS-Ct)/λm×100%,,,=,×100%,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,35,9 試驗(yàn)結(jié)果分析,樣品氯化鉀

23、注射液干擾試驗(yàn)結(jié)果,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,36,回收率R：以樣品濃度C=1.0mg/ml（即稀釋倍數(shù)為1)以9、10、11和12管為例，計(jì)算該濃度下的回收率（R）。 R=(CS-Ct)/λm×100% =（0.4654-0.0122）/0.5×100% =90%注：如果檢測結(jié)果小于檢測限，計(jì)算回收率時(shí)以0計(jì)。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,3

24、7,10 結(jié) 論 結(jié)論：依據(jù)2010版附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”，氯化鉀注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查干擾試驗(yàn)1.0mg/ml和0.5mg/ml的稀釋液符合試驗(yàn)要求，對鱟試驗(yàn)沒有干擾。常規(guī)檢查選用其中任一濃度即可。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,38,五 檢查法1 檢測濃度的選擇 如樣品有干擾作用，選擇符合干擾試驗(yàn)要求的第二個(gè)濃度作為日常檢查的濃度。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy

25、.com,39,2 試驗(yàn)有效條件試驗(yàn)必須符合以下三個(gè)條件方為有效： 標(biāo)準(zhǔn)曲線要符合 “可靠性試驗(yàn)”中的要求；計(jì)算出的內(nèi)毒素的回收率要在50%-200%的范圍內(nèi)；陰性對照的反應(yīng)時(shí)間應(yīng)大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,40,,3 結(jié)果判斷 若供試品溶液所有平行管的平均內(nèi)毒素濃度乘以稀釋倍數(shù)后，小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品符合規(guī)定。若大于或等于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判

26、供試品不符合規(guī)定。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,41,六、光度測的特點(diǎn)1、定量儀器取值方法2、定量法的特點(diǎn)3、動(dòng)態(tài)濁度法和凝膠法的比較,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,42,1 定量儀器取值方法,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,43,1.1 透光率反應(yīng)時(shí)間取值法T0.95 在鱟試驗(yàn)中，細(xì)菌內(nèi)毒素濃度與反應(yīng)達(dá)到某一狀態(tài)的時(shí)刻有關(guān)，只要測出這

27、一時(shí)間就可算出內(nèi)毒素的實(shí)際濃度，這一過程叫反應(yīng)時(shí)間取值方法。透光率反應(yīng)時(shí)間取值法使用透光率描述鱟試劑的濁度變化。日本的ET-201型儀器采用該方法，即t0.95法。但該法所描述的透光率反應(yīng)曲線與反應(yīng)產(chǎn)物的量呈非線性關(guān)系。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,44,1.2 光密度反應(yīng)時(shí)間取值法T0.02 光密度限值法預(yù)設(shè)一個(gè)光密度OD值，當(dāng)反應(yīng)曲線從開始上升到預(yù)設(shè)值時(shí)經(jīng)理的時(shí)間作為反應(yīng)時(shí)間，此方法的優(yōu)點(diǎn)是時(shí)刻

28、變化的OD值與反應(yīng)產(chǎn)物的數(shù)量成正比，也就是吸光度變化曲線與凝膠產(chǎn)物的產(chǎn)生關(guān)系呈線性，取OD值上升0.02作為預(yù)設(shè)點(diǎn)，該點(diǎn)在反應(yīng)曲線上的位置為濁度開始快速變化的時(shí)期，該取值能夠快速、穩(wěn)定的獲得反應(yīng)時(shí)間。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,45,1.3 濁度反應(yīng)時(shí)間取值法T50 濁度-時(shí)間曲線法每一管的濁度總是從0-1，這就是所謂“歸一法”，這種動(dòng)態(tài)濁度法必須求出濁度達(dá)到0.5的時(shí)間t50， t50與拐點(diǎn)極為

29、接近，用該點(diǎn)代替拐點(diǎn)。 T50法很有優(yōu)勢，但要求每次鱟試驗(yàn)必須達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)，否則無法獲得終末透光強(qiáng)度，無法測得完整的濁度曲線，也就求不出t50。該法的缺點(diǎn)：耗時(shí)太長。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,46,2 定量法的特點(diǎn)（1）通過反應(yīng)曲線，直觀顯示鱟試劑的反應(yīng)過程；通過反應(yīng)曲線，考察樣品中的干擾。（2）快速、準(zhǔn)確測到樣品中的內(nèi)毒素含量，有利于藥品生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制；可以檢測臨床病人體液中的內(nèi)毒素含量，

30、作為疾病診斷的依據(jù)。（3）操作簡單、可靠性高。,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,47,3 動(dòng)態(tài)濁度法和凝膠法的比較,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,48,2024年2月25日星期日,博康www.zj-hy.com,49,湛江博康海洋生物有限公司講 解 董光宴通信地址：廣東省湛江市麻章區(qū)瑞云南路188號郵政編碼：524094聯(lián)系電話：0759-2732555 1382