質(zhì)譜技術(shù)在微生物鑒定和生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1、質(zhì)譜技術(shù)在微生物鑒定和生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,306醫(yī)院檢驗科 易勇2016.03,島津（梅里埃）MALDI TOF產(chǎn)品系列,Linear only MALDI-TOF,Linear and reflectron MALDI-TOF PSD capability,Linear and reflectron MALDI-TOF/TOF PSD & CID capability,Unique instrument

2、 MALDI-ion trap-TOF reflectron only MSn capability High resolution and high mass accuracy,布魯克 各類現(xiàn)代生物質(zhì)譜：,離子阱,MALDI TOF/TOF,ESI-Q-TOF,FTMS,質(zhì)譜儀的工作原理,質(zhì)譜儀是利用電磁學(xué)原理，使帶電的樣品離子按質(zhì)荷比進行分離的裝置。離子電離后經(jīng)加速進入磁場中，其動能與加速電壓及電荷z有關(guān)，即

3、 m/z = 2U/v2 其中z為離子的電荷，U為加速電壓，m為離子的質(zhì)量，v為離子初加速后的運動速度。具有速度v的帶電粒子進入質(zhì)譜分析器的電磁場中，根據(jù)所選擇的分離方式，最終各種離子按質(zhì)荷比（m/z）的不同實現(xiàn)分離。,電離源,質(zhì)譜儀中產(chǎn)生離子的裝置稱為離子源(ion source)。電離源的功能是將進樣系統(tǒng)引入的氣態(tài)樣品分子轉(zhuǎn)化成離子

4、。由于離子化所需要的能量隨分子不同差異很大，因此，對于不同的分子應(yīng)選擇不同的離解方法。通常稱能給樣品較大能量的電離方法為硬電離方法，而給樣品較小能量的電離方法為軟電離方法。 質(zhì)譜技術(shù)中的幾種離子源,基質(zhì)輔助激光解吸離子化 (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization，MALDI)2. 電噴霧離子化(Electrospray ionization，ESI),,,,,,,,,,,,,,,Sam

5、ple target,,,,Ion optics,,Linear detector,,Laser,MALDI-TOF MALDI: 線性工作原理,Mix matrix & sample on targetFire laser at matrix/sampleIonize sample (solid to gas phase)Accelerate / extract ionsSeparate ions in analyze

6、rRecord spectrum at detector,Time of flight (TOF) mass analyzer (field free),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0,,20,,40,,60,,80,,100,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,10000,,20000,,30000,,40000,m/z,,,+ve mode[M+H]+ ions,,MALDI基質(zhì)輔助激光解析附原理: St

7、reptococcus pneumoniae:,mass signals matching to ribosomal proteins (considering possible methionine cleavage and/or methylation) are marked in red~50% of peaks unambiguously represent ribosomal proteins,protein masses

8、obtained from the Swiss-Prot/TrEMBL sequence database,質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu),一、真空系統(tǒng)質(zhì)譜儀的離子產(chǎn)生及經(jīng)過系統(tǒng)必須處于高真空狀態(tài)(離子源真空度應(yīng)達1.3×10-4 - 3×10-5 pa，質(zhì)量分析器中應(yīng)達1.3×10-6 pa)。若真空度過低，則會造成離子源燈絲損壞、本底增高、副反應(yīng)過多，從而使圖譜復(fù)雜化、干擾離子源的調(diào)節(jié)、加速極放電等問題。一般質(zhì)譜儀

9、都采用機械泵預(yù)抽真空后，再用高效率擴散泵連續(xù)地運行以保持真空。圖5.1 質(zhì)譜儀的構(gòu)成,微生物鑒定方法,耗時,氣質(zhì)法（GC-MS）脂肪酸，小分子糖,MALDI-TOF MS,21-Mar-24,10,微生物鑒定新方法（MALDI TOF）,比現(xiàn)有方法鑒定更多生物多樣性的病原體分析時間僅1-2 minutes,,現(xiàn)代微生物分類學(xué):蛋白組學(xué) & 基因組學(xué),Protein,,,DNA,Genome,Proteome,DNA F

10、ingerprint,MassFingerprint,SpeciesDefinition & Determination,,,MALDI-TOF MS,12,12,,不同細菌代表性指紋圖譜不同,各菌種代表性峰型分布存在顯著差異，有助于鑒定各個菌種！,,,13,13,腸桿菌 （Enterobacteriaceae）MS圖譜示:科, 屬, 種特異性峰值,部分峰值是多數(shù)菌種共有的（如 m/z 4365:核糖體蛋白 L36),峰

11、值有 科, 屬, 種或 亞種-特異性,種間特異性代表峰值用來區(qū)分不同菌種,,,,核糖體蛋白不受生長條件影響,Mass spectra of Proteus mirabilis DSM 4479 at different incubation timesNo major qualitative changes in peak patterns distinguishing family, genus and speciesDecr

12、ease of signal intensity over timePresence and absence of peaksIdentification with >99% confidence,SARAMIS 工作流程,,微生物鑒定流程,生長在固體培養(yǎng)基上的菌落,全細胞 MALDI-TOF譜圖,數(shù)據(jù)庫中參考譜圖,輸出可信鑒定結(jié)果,找到匹配度最可信的譜圖,17,鑒定結(jié)果界面,只需數(shù)秒，全自動添加新采集數(shù)據(jù)至鑒定結(jié)果界面

13、！,不同顏色代表不同置信水平 深綠: 99.9% 淺綠: 90-99.9% 黃色: 85-90% 白色: 70-85%低于70%不顯示置信值紅色: 提醒復(fù)雜的結(jié)果,,匹配2種或以上菌種，置信度>99% :鑒定混合菌,SARAMIS鑒定混合菌種,A mass spectrum of a mixed sample containingPseudomonas aeruginosa and

14、 Achromobacter xylosoxidansShows peaks specific to both species,單核增生性李斯特菌Listeria monocytogenes (Lm) 兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌，自然界分布廣泛，是食源性李斯特?。ㄈ诵蠊不疾。┑闹虏≡?，低溫仍具有增殖能力對老年人，嬰兒，孕婦和免疫缺陷者的致死率是 20-30%該菌經(jīng)常存在于速食食品中

15、Ex. About 2,500cases/year in USA,食品安全 Tokyo Marine University, Prof Kimura and Dr. Takahashi,,Eatable without heated and cocked or cocked food, ex., ham, daily product, salad, smoked food etc,現(xiàn)有檢測方法需要2步驟和選擇培養(yǎng)基，耗時6天,Yaku

16、lt (養(yǎng)樂多),乳酸菌生產(chǎn)質(zhì)量控制品種改良Performance + SARAMIS,Classified as genus => species => strain“Thickness” of database is important.,,From 2011 European society of clinical microbiology and infections disease,菌種鑒定準確度,21-

17、Mar-24,22,SARAMIS：Spectral ARchive And Microbial Identification System,數(shù)據(jù)庫含有超級譜圖（ SuperSpectra ）和參考譜圖（ Reference Spectra ）使用者可以創(chuàng)建和儲存超級譜圖或參考譜圖軟件包可實現(xiàn)譜圖的存儲，分析和比較使用者可以做聚類分析，創(chuàng)建系統(tǒng)樹圖用于菌株分型,SARAMIS 菌種特異峰型,,合成譜圖包含所有在個體譜圖中出

18、現(xiàn)頻率大于閥值的所有峰 (如：在各譜圖中出現(xiàn) 70% 的)在超級譜圖中，所有峰值根據(jù)他們對所代表的菌種特異性而賦予權(quán)重值具有科、屬特異性的峰值權(quán)重低，這些峰值不支持菌種鑒定具有菌種特異性的峰值權(quán)重則會加重,,,,SARAMIS – 比較工具,,,Cluster analysis of selected reference and sample mass spectra,Comparison to mass spectral pa

19、tterns of reference spectra in the database,,,,,,在SARAMIS數(shù)據(jù)庫中一個菌種的典型代表包含典型和非典型菌株（基于質(zhì)譜圖譜，基因組學(xué)，表型數(shù)據(jù)）,,,,,,,,atypical reference isolates are over-represented in SARAMIS,,,,,phylogenetic distance,phylogenetic distance,freque

20、ncy,frequency,自然界菌種多樣性,,SARAMIS與LIMS系統(tǒng),,Culture from the stock in gricelol,Culture in various conditions,Collect isolates from our lab and other facilities (10),Measure MS spectra and construct Database,,,Apply to uncert

21、ainty, which reduce stability of identification,Difference in colony in a same media ? 2HW product tolerance ? 3 systemOperator ? 12peopleCulture media ? maximum 5 kinds Culture length ? 24, 48, 72h Culture ven

22、der? 3 venders,Max 3,240 spectra,深度透視數(shù)據(jù)庫,MicroID system intrucduction,Version 1.0,自動鑒定界面,比對鑒定界面,MicroID,MALDI-TOF MS 微生物鑒定優(yōu)勢,一種對所有微生物都適用的方法無需預(yù)選測試與現(xiàn)代分類學(xué)結(jié)果一致高度配合有特殊需求使用者可擴展新菌種及其應(yīng)用非常耐用且重復(fù)性高樣品準備過程非常簡化可進行高通量分析絕佳成本與效益比

23、,32,AXIMA MALDI: 線性 & 反射不只是微生物鑒定,MALDI TOF全面解決方案,布魯克 各類現(xiàn)代生物質(zhì)譜：,離子阱,MALDI TOF/TOF,ESI-Q-TOF,FTMS,高分辨質(zhì)譜儀 全方位應(yīng)用,天然產(chǎn)物分析藥物研究蛋白質(zhì)組學(xué)代謝組學(xué)............,,,micrOTOFQ,micrOTOFQ,,,Dry Gas Heater,Orthogonal Accele

24、rator,Glass Capillary,Collision Gas Supply,Hexapole,電噴霧離子源,去溶劑系統(tǒng),飛行管,檢測器,反射鏡,離子聚焦系統(tǒng),離子漏斗式傳輸,,四級桿Q,碰撞池,布魯克公司獨家專利設(shè)計：離子漏斗式傳輸系統(tǒng),離子流方向>>>,離子傳輸率大大提高，從而提高靈敏度。增寬傳輸離子質(zhì)量范圍,離子流方向>>>,傳統(tǒng)的錐式離子傳輸,micrOTOFQ適用范圍

25、：,電噴霧四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀,精確質(zhì)量 (<3ppm),micrOTOFQ：獨特的三維信息,MS/MS提供結(jié)構(gòu)信息,電噴霧四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀,SigmaFit?參數(shù)（同位素峰形匹配）,精確質(zhì)量 (<3ppm),micrOTOFQ：獨特的三維信息,MS/MS提供結(jié)構(gòu)信息,電噴霧四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀,SigmaFit?參數(shù)（同位素峰形匹配）,,SigmaFit?參數(shù)—— 同位素峰形的匹配,,,,,2,,,1,,,

26、3,,,4,,,5,,,6,,,7,,,8,,,9,,,10,,,11,,,,,,,C254H383N65O75S6 ,5735.65,,,0,,,,2000,,,,4000,,,,6000,,,,Intens.,,,,,1146.0,,,,,,,1146.5,,,,,,,1147.0,,,,,,,1147.5,,,,,,,1148.0,,,,,,,1148.5,,,,,,,1149.0,,,,,,,1149.5,,,,,,,1150.

27、0,,,,,,,m/z,,,1,,,2,,,3,,,4,,,5,,,6,,,7,,,8,,,9,,,10,,,11,,,,模擬同位素分布峰形,實測同位素分布峰形,SigmaFit?參數(shù)—— 同位素峰形的匹配,SigmaFit 參數(shù) =0,SigmaFit 參數(shù) >>0,,,436.0398,Experimental,,,436.0400,C12H22NO10S3,,,436.0367,C15H18NO10S2,,0,,,2,

28、,,4,,,6,,,,0,,,2,,,4,,,6,,,,435,,436,,437,,438,,439,,440,,441,,442,m/z,sigma = 0.0167,sigma = 0.0231,Intensity x 104,A,B,C,鑒定化合物的有效工具-- SigmaFit,,兩種可能元素組成的確定,分子量 >500Da未知物的元素組成預(yù)測？,人參提取液（稀釋倍數(shù) 1:100; HPLC-microTOF Q）,

29、當設(shè)置誤差范圍 <5 ppm時：,,,,171個可能的分子式,Generate Molecular Formula,,,16個可能的分子式,當設(shè)置誤差范圍 < 3ppm 時：,Generate Molecular Formula,,C55H93O25,,用SigmaTM參數(shù)比較同位素峰形匹配，選擇Sigma值最小的分子式，即該化合物的分子式為：,Generate Molecular Formula,SigmaTM參數(shù)用于比較

30、同位素峰形匹配,,,,,,,,1153.60114,1154.60456,1155.60742,1156.61021,C55H93O25 ,1153.60,,,,,,,,1153.59527,1154.59868,1155.60170,1156.60459,C62H89O20 ,1153.59,,0,,,,,,500,,,,,,1000,,,,,,1500,,,,,,2000,,,,,,2500,,,,,,Intens.,,0,,,,,

31、,500,,,,,,1000,,,,,,1500,,,,,,2000,,,,,,2500,,,,,,,,,,1153,,,,,,1154,,,,,,1155,,,,,,1156,,,,,,1157,,,,,,1158,,,,,,1159,,,,,m/z,C55H93O25,C62H89O20,SigmaTM = 0.0171,SigmaTM = 0.0540,,,,,未知多肽測序測定 GluFib: MS/MS of m/z = 78

32、5.8 (+2),—— 動態(tài)范圍的實際意義,高質(zhì)量準確度測定與液質(zhì)聯(lián)用,常規(guī)高分辨質(zhì)譜儀在液質(zhì)聯(lián)用時面臨的挑戰(zhàn),,LC/MS高質(zhì)量準確度測定在法醫(yī)藥物監(jiān)測中的應(yīng)用Dept. of Forensic MedicineUniversity of Helsinki, Finland,Rapid Commun. Mass Spectrum 2006; 20: 1161-1167,尿樣 – 法醫(yī)毒理分析,總離子流色譜圖 TIC,準確質(zhì)量

33、動態(tài)范圍forensic screening: positive hits,error: 2.98 ppmsigma: 0.0165,error: 0.19 ppmsigma: 0.0084,Signal intensity: 8 x103,Signal intensity: 2 x106,布魯克集團公司,Affiliated Companies,,,,,豐收：土地、種子、氣候......質(zhì)譜儀細菌鑒定：細菌純培養(yǎng)、完善的數(shù)