獸藥殘留分析技術(shù)

1、獸藥殘留分析技術(shù),陳 品,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,第一節(jié) 概述,一、基本概念,指給畜禽等動(dòng)物用藥后蓄積或貯存在動(dòng)物細(xì)胞、組織和器官內(nèi)的藥物或化學(xué)物質(zhì)的原形、代謝產(chǎn)物和雜質(zhì)。,1.獸藥殘留（veterinary drug residue),2.總殘留物（total residue),指食品動(dòng)物用藥后，動(dòng)物產(chǎn)品的任何食用部分中某種藥物殘留的總和，或指動(dòng)物組織中可被提取的原型藥物及任何具有毒理學(xué)意義的代謝產(chǎn)物的總稱。,3.標(biāo)示殘

2、留物（marker residue),4.靶組織(target tissue）,指總殘留物中，在動(dòng)物體內(nèi)消除緩慢、殘留量高、殘留期長、性質(zhì)穩(wěn)定、有靈敏方法檢測的組分。,指殘留量高、殘留物最后消除的組織。,二、獸藥殘留的原因,不正確用藥,不遵守休藥期,宰前用藥物掩飾臨床癥狀，以逃避檢查,以未經(jīng)批準(zhǔn)的藥物作飼料添加劑,藥物標(biāo)簽指示用法不當(dāng),加工貯存過程中污染,接觸環(huán)境中污染的藥物,三、獸藥殘留種類,β-興奮劑 克倫特羅 沙丁胺醇 來

3、克多巴胺,抗菌藥 硝基咪唑類、,1.違禁藥物,甲狀腺抑制劑 丙硫氧嘧啶 甲巰咪唑,激素 己烯雌酚、睪酮、群勃龍、雌二醇、孕酮等,鎮(zhèn)靜劑 氯丙嗪、安定、利血平,皮質(zhì)激素類 地塞米松、氫化可的松,呋喃類、氯霉素,2.毒性較大、休藥期較長的藥物,呋喃唑酮,阿維菌素類,磺胺類 磺胺二甲嘧啶 磺胺喹惡啉,喹惡啉類 卡巴氧 喹乙醇 乙酰甲喹,二氨嘧啶類 TMP,四環(huán)素類 金霉素 土霉素,苯并咪唑類

4、 阿苯達(dá)唑 氟苯咪唑,左咪唑,氯羥吡啶 雙甲咪 二嗪農(nóng)等,工業(yè)污染物 如重金屬,環(huán)境污染物 如二惡英,3.其他,四、獸藥殘留的危害,過敏反應(yīng),毒性作用,激素樣作用,耐藥性,環(huán)境污染,1.過敏反應(yīng),經(jīng)常食用含低劑量抗菌藥物的食品能使易感個(gè)體出現(xiàn)過敏反應(yīng)，如青霉素、四環(huán)素、磺胺胺類藥物及某些氨基糖苷類抗生素等。 這些藥物具有抗原性，刺激機(jī)體內(nèi)抗體的形成，造成過敏反應(yīng)，嚴(yán)重者可引起休克、喉頭水腫、呼吸困難等嚴(yán)重

5、癥狀。,呋喃類引起人體的不良反應(yīng)主要是胃腸反應(yīng)和過敏反應(yīng)，表現(xiàn)在以周圍神經(jīng)炎、藥熱、嗜酸性白細(xì)胞增多為特征的過敏反應(yīng)。,磺胺類藥物的過敏反應(yīng)表現(xiàn)為皮炎、白細(xì)胞減少、溶血性貧血和藥熱。抗菌藥物殘留所致變態(tài)反應(yīng)比起食物引起的其他不良反應(yīng)所占的比例小。,青霉素藥物引起的變態(tài)反應(yīng)，輕者表現(xiàn)為接觸性皮炎和皮膚反應(yīng)，嚴(yán)重者表現(xiàn)為致死性過敏性休克。,2.毒性作用,急性中毒 如β-興奮劑,慢性中毒,磺胺類 腎損害,氯霉素 再生障礙性

6、貧血,四環(huán)素 骨骼和牙齒發(fā)育,苯并咪唑類 致畸、致癌、致突變,二惡英 肺、肝腫瘤,3.耐藥性,動(dòng)物在經(jīng)常反復(fù)接觸某一種抗菌藥物后，其體內(nèi)的敏感菌株將受到選擇性的抑制，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，使耐藥菌株大量繁殖。人體經(jīng)常食用含藥物殘留的動(dòng)物性食品，動(dòng)物體內(nèi)的耐藥菌株可傳播給人體，當(dāng)人體發(fā)生疾病時(shí)，就給臨床上感染性疾病的治療帶來一定的困難，延誤正常的治療。,已發(fā)現(xiàn)長期食用低劑量的抗生素能導(dǎo)致金黃色葡萄菌耐藥菌株的出現(xiàn)，也能引

7、起大腸桿菌耐藥菌株的產(chǎn)生。,在正常條件下，人體腸道內(nèi)的菌群與人體能相互適應(yīng)，如某些菌群能抑制其他菌群的過度繁殖，某些菌群能合成B族維生素和維生素K以供機(jī)體使用。過多應(yīng)用藥物會(huì)使這種平衡發(fā)生紊亂，造成一些非致病菌死亡，使菌群的平衡失調(diào)，從而導(dǎo)致長期的腹瀉或引起維生素缺乏等反應(yīng)。,4.激素樣作用,β-興奮劑（瘦肉精）引起中毒。,長期食用含低劑量激素動(dòng)物性食品，腫瘤發(fā)生率上升。,同化激素用于促進(jìn)動(dòng)物生長，提高飼料利用率，目前多數(shù)國家已禁用。,

8、5.環(huán)境污染,動(dòng)物用藥后，藥物隨糞、尿排到環(huán)境中，對(duì)土壤微生物和昆蟲、水體均造成影響；在土壤中檢測到金霉素；在土壤中殘留的藥物，可通過生物富集和生物放大作用影響人和其他動(dòng)物；,五、最高殘留限量和休藥期,1.食品動(dòng)物（food-producing animal) ：指各種人工養(yǎng)殖供人食用的動(dòng)物。,2.可食組織（edible tissue) ：指全部可食用的動(dòng)物組織，包括肌肉和臟器等。,3.最高殘留限量（maximum residue

9、 limit，MRLs)：,指食品動(dòng)物用藥后，允許存在于食物表面或內(nèi)部的殘留藥物或化學(xué)物質(zhì)的最高量或濃度。一般以鮮重計(jì)，用mg/kg、? g /kg或mg/kg、 ? g/L。,獸藥最高殘留限量（MRL）的確定,最大無毒性作用劑量是根據(jù)最敏感實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（一般為大鼠、兔、狗）的毒理學(xué)試驗(yàn)，對(duì)動(dòng)物不產(chǎn)生任何毒性的最大劑量。實(shí)際是一種從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外推到人的安全性數(shù)據(jù)。具體來講，就是根據(jù)獸藥的三性（急性、亞慢性／慢性）和三致（致突變、致畸胎、致癌）

10、試驗(yàn)結(jié)果得來。,（1）最大無毒性作用劑量（No observed effect level，NOEL）的確定,（2）每日允許攝入量（Acceptable Daily Intake，ADI）的確定,每日允許攝入量是指可以被一個(gè)人安全地消費(fèi)而不產(chǎn)生任何作用的量。ADI=NOEL/安全因子，其中安全因子，如果NOEL是根據(jù)急性試驗(yàn)得到的，安全因子為1000；如果NOEL是根據(jù)慢性試驗(yàn)得到的，安全因子則為100。,（3）最高殘留限量（Maxim

11、um Residue Limit，MRL）的確定,根據(jù)ADI，計(jì)算出各種組織中的最高殘留限量。,其中，組織消費(fèi)量如下（按WTO推薦）：　　　　肌肉 300g　　　　脂肪 50g　　　　肝臟 100g　　　　腎臟 50g　　　　蛋 100g　　　　奶 1.5L,4.休藥期（withdrawal time

12、),指食品動(dòng)物從停止給藥到許可屠宰或其產(chǎn)品許可上市的間隔時(shí)間。,（1）影響藥物殘留消除和休藥期的因素,藥物的劑型與劑量給藥途徑合并用藥和重復(fù)用藥動(dòng)物年齡、性別、品種、個(gè)體差異胃腸道環(huán)境及機(jī)能狀態(tài),（2）休藥期估算方法,估算休藥期的程序確定靶組織確定被測殘留物研究組織殘留消除規(guī)律數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理,根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)估算按實(shí)際給藥劑量和途徑給藥后停藥在MRLs附近設(shè)置至少4個(gè)采樣點(diǎn)，采取靶組織樣品對(duì)樣品進(jìn)行殘留分析繪制殘留消除

13、半對(duì)數(shù)曲線圖，用直線回歸法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理將MRLs作為統(tǒng)計(jì)量估計(jì)時(shí)間的99%置信區(qū)間，取上限時(shí)間作為休藥期根據(jù)組織藥動(dòng)學(xué)參數(shù)估算,六、監(jiān)控和防范獸藥殘留的措施,加強(qiáng)藥物生產(chǎn)和使用管理，完善法規(guī)嚴(yán)格規(guī)定藥物的休藥期和允許殘留量對(duì)藥物進(jìn)行安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)加強(qiáng)獸藥殘留分析方法的技術(shù)研究,第二節(jié) 殘留分析,1.篩選方法（screening method）,指在一定濃度內(nèi)，用于快速檢測大量樣品的方法。如微物法、免疫化學(xué)法。,

14、一、 殘留分析中的常用術(shù)語,篩選方法的要求:必須限定方法的特異性允許出現(xiàn)假陽性，最低限度控制假陰性檢測限和定量限必須適合檢測目的方法快速簡便,2.常規(guī)方法（routine meithod）,指可以基本確定樣品中某種殘留物存在和確定其濃度的方法。,要求具有準(zhǔn)確的定量分析能力不一定具有準(zhǔn)確的定性分析能力,方法 HPLCGC,3.確證方法,指用于測定并確證篩選方法和常規(guī)方法檢測為陽性結(jié)果的樣品中是否存在藥物殘留及殘留量。,確

15、證方法的要求特異性高、定量分析能力強(qiáng) 精密度、準(zhǔn)確度達(dá)到規(guī)定檢測限和定量限適合檢測目的,常用方法 GC-MS、LC-MS、GC-IR、LC-IR,4.參比方法 （reference method）,指以被某國家或國際機(jī)構(gòu)驗(yàn)證和接受的法定性確證方法，可用于驗(yàn)證有關(guān)方法的精確度和精密度。,5.標(biāo)準(zhǔn)分析物（standard analyte）,指在分析中用作參比的高純度已知物質(zhì)，一般用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線或測定添加回收率。,6.特異性

16、（specificity ）,指樣品基質(zhì)中其他組分共存時(shí)該分析方法對(duì)待測物的分辨能力，有時(shí)稱選擇性。,7.準(zhǔn)確度（accuracy）,指測定值與其真實(shí)值的接近程度，反應(yīng)分析結(jié)果的正確性。通常用添加回收率（recovery）表示。,添加濃度m（mg/kg） 回收率（％）　　m≥0.1 80～110　　0.1＞m≥0.01 70～1

17、10　　001＞m≥0.001 60～120　　m≤0.001 50～120,不同添加濃度的回收率原則要求如下：,8.精密度（precision）,指在限定條件下，用某種測定方法重復(fù)測定同一均質(zhì)樣品所得測定值的彼此接近程度。反應(yīng)分析結(jié)果的重復(fù)性和重現(xiàn)性。通常用變異系數(shù)（CV）或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）表示。,不同待測物濃度的精密度要求,9.重復(fù)性,重

18、復(fù)性（repeatability）：指在短期內(nèi)相同條件下，測得的同一樣品各個(gè)相互獨(dú)立分析結(jié)果的符合程度。,相同條件：同一實(shí)驗(yàn)室、同一操作者、同一批號(hào)試劑、同一樣品、同一儀器、同樣分析方法,表示方法：日內(nèi)變異系數(shù)或批內(nèi)變異系數(shù)日間變異系數(shù)或批間變異系數(shù),10.重現(xiàn)性,重現(xiàn)性（reproducibility）：指在不同試驗(yàn)條件下，測得同一樣品各個(gè)相互獨(dú)立的分析結(jié)果的符合程度。,不同條件：不同實(shí)驗(yàn)室、不同操作者、不同儀器、同一樣品、相同的

19、分析方法。,11.檢測限與定量限,檢測限（limit of detection，LOD）：指某種分析方法能夠從樣品的背景信號(hào)中檢出待測物存在的最低濃度。反應(yīng)分析方法的靈敏度，一般為空白測定平均值加2倍或3倍標(biāo)準(zhǔn)差（信/噪≥3）。,定量限（limit of quantitation）：指某種分析方法能夠?qū)悠反郎y物進(jìn)行定量測定的最低濃度。具有精密度和準(zhǔn)確度要求，反應(yīng)方法在低濃度端分析結(jié)果的可靠性，為空白測定平均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)差。,二

20、、殘留分析的原理,獸藥殘留的特點(diǎn)殘留水平低 ，大多在0.001～1mg/kg樣品基質(zhì)復(fù)雜，殘留物不易分離純化,基本原理：用物理或化學(xué)的方法將待測殘留組分從樣品中提取、分離、純化，溶于適當(dāng)溶劑，利用其光學(xué)或波譜特性，進(jìn)行定性定量檢測。,三、殘留分析方法的分類,1.按分離或檢測原理分：,理化分析法 波譜法、色譜法及聯(lián)用技術(shù) HPLC、GC、TLC、ＧＣ-ＭＳ、LC-MS,免疫分析法 放射免疫 酶聯(lián)免疫、熒光免疫,生物

21、測定法 微生物法 放射受體測定法,篩選方法 常規(guī)方法確證方法參比方法,3.按被測組分分,單組分多組分,2.按殘留分析目的和用途分,四、殘留分析方法的建立,查閱文獻(xiàn)、設(shè)計(jì)分析方法建立基本測定方法 包括確定測定方法、線性范圍建立樣品處理方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 外標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)法確定檢測限和定量限測定樣品回收率和變異系數(shù)穩(wěn)定性分析 溫度 放置時(shí)間,（一）殘留檢測方法標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu),（二）樣品提取及分析技術(shù)路線,（三）

22、分析方法評(píng)價(jià)及其標(biāo)準(zhǔn),檢測限與定量限添加回收率變異系數(shù)線性范圍特異性與參比方法進(jìn)行相關(guān)性比較實(shí)驗(yàn)室協(xié)同研究,（四）分析結(jié)果判定,陽性結(jié)果MRL為0 殘留量≥分析方法的檢測限確定MRL 殘留量≥ MRL篩選方法和常規(guī)方法需用確證方法確證陰性結(jié)果MRL為0 未能檢出確定MRL 殘留量＜ MRL篩選方法和常規(guī)方法可以肯定,（五）分析方法報(bào)告,概述 依據(jù)、現(xiàn)狀、問題樣品制備與保存測定方法