酶工程第五章酶、細(xì)胞、原生質(zhì)體固定化

1、酶工程（Enzyme Engineering）,——讓工廠高效、安靜、美麗如畫(huà)的工程,工作原理: 利用試紙上的固定化酶 (葡萄糖氧化酶, Glucose oxidase , GOD) 與血液中的葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)生的電流來(lái)測(cè)血糖值。,強(qiáng)生穩(wěn)豪倍易血糖儀,葡萄糖氧化酶電極,酶電極示意圖 ß-D-葡萄糖＋O2 D-葡萄糖酸-1, 5-內(nèi)酯＋H2O2,,半透膜,酶膠層,感應(yīng)電極,第六章 酶、細(xì)胞、

2、原生質(zhì)體固定化,1. 酶（Enzyme）,Organic chemical substance (a catalyst) formed in living cells, able to cause changes in other substance without being changed itself.活細(xì)胞產(chǎn)生的，能在細(xì)胞內(nèi)外起催化作用的生理活性物質(zhì)。,知識(shí)點(diǎn)回顧,酶,（全酶）= 酶蛋白 + 輔因子,酶的催化專(zhuān)一性主要決定于

3、酶蛋白部分。輔因子通常是作為電子、原子或某些化學(xué)基團(tuán)的載體。,2. 酶的組成,必需基團(tuán)：這些基團(tuán)若經(jīng)化學(xué)修飾使其改變，則酶的活性喪失。,活性中心：酶分子中直接與底物結(jié)合，并和酶催化作用直接相關(guān)的部位。,必需基團(tuán),3. 酶的活性中心（active center）,優(yōu)點(diǎn)：① 催化效率高 ② 專(zhuān)一性強(qiáng) ③ 反應(yīng)條件溫和 ④ 催化活性受到調(diào)節(jié)和控制

4、,4. 酶的特性,缺點(diǎn)：① 溶液酶很不穩(wěn)定 ② 增加分離的難度和費(fèi)用 ③ 影響產(chǎn)品質(zhì)量 ④ 回收困難，一次性使用,固定化技術(shù)——固定化酶（immobilized enzyme）,有效改善方法之一思路：設(shè)計(jì)一種方法，將酶束縛于特殊的相中，使它與整體分開(kāi)但仍能進(jìn)行底物和效應(yīng)物的分子交換。效果：固定化的酶可像一般化學(xué)反應(yīng)中的固體催化劑一樣，既有

5、酶催化特性，又有一般化學(xué)催化劑可回收、反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，并可使生產(chǎn)工藝連續(xù)化、自動(dòng)化。,酶工程原理和基本過(guò)程 菌種→擴(kuò)大培養(yǎng)→發(fā)酵→發(fā)酵酶液→酶的提取→ 酶成品

6、 原料→ 前處理→ 殺菌→ 酶反應(yīng)器 ← ↓ 反應(yīng)液→ 產(chǎn)品提取→ 產(chǎn)品,,,酶的固定化,,固定化酶發(fā)展歷史,1916年，Nelson和Griffin發(fā)現(xiàn)

7、酶的固定化現(xiàn)象（蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性）。 20世紀(jì)50年代，Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯樹(shù)脂為載體，分別制成固定化的胃蛋白酶、淀粉酶等。1969年，千佃一郎首次在工業(yè)規(guī)模上用固定化氨基?；笍幕旌习被嶂猩a(chǎn)L-氨基酸。 1971年，第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議在美國(guó)召開(kāi)，會(huì)議的主題是固定化酶（immobilized enzyme） 。 我國(guó)：1970年（中科院微生物所、上海生化所）。,固定化酶發(fā)展歷史

8、,1973年，日本首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化大腸桿菌菌體中的天冬氨酸酶生產(chǎn)L-天冬氨酸。20世紀(jì)70年代后期：固定化細(xì)胞技術(shù)1982年，日本首次用固定化原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸近年來(lái)，隨著納米材料和磁性材料等新材料的出現(xiàn)，使固定化酶又成為研究熱點(diǎn)，目前酶的固定化方法已超過(guò)200種。,本章主要內(nèi)容,第一節(jié) 酶固定化第二節(jié) 細(xì)胞固定化第三節(jié) 原生質(zhì)體固定化,第一節(jié) 酶的固定化,水溶性酶,水不溶性載體,水不溶性酶（固定化酶）,早期： 水

9、不溶酶（water insoluble enzyme） 固相酶（solid phase enzyme）,一、固定化酶的制備,1. 固定化酶（Immobilized enzyme）定義限制或固定于特定空間位置的酶，具體來(lái)說(shuō)，是指借助物理或化學(xué)方法將酶固定于水不溶性載體，使得酶與整個(gè)流體分隔開(kāi)，但仍能發(fā)揮催化效能的酶制劑形式。制備固定化酶的過(guò)程叫做酶的固定化。,優(yōu)點(diǎn),（1）提高酶穩(wěn)定性（2）可反復(fù)或連續(xù)使

10、用；易于和反應(yīng)產(chǎn)物分開(kāi)；酶的使用效率提高，成本降低（3）酶反應(yīng)過(guò)程可嚴(yán)格控制（4）產(chǎn)物溶液無(wú)酶殘留，簡(jiǎn)化提純工藝；增加產(chǎn)物收率，提高產(chǎn)物質(zhì)量（5）較游離酶更適合多酶反應(yīng),缺點(diǎn),（1）固定化時(shí)酶活有損失（2）增加了生產(chǎn)初始成本（3）只能用于可溶底物且較小分子（4）與完整菌體相比不適宜于多酶反應(yīng),2.固定化酶的特點(diǎn),3. 固定化酶制備原則,（1）維持酶的催化活性及專(zhuān)一性（2）應(yīng)有最小的空間位阻（3）酶與載體必須結(jié)合牢固，穩(wěn)定

11、性好（4）載體不與底物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)（5）成本要低，有利于生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化,4. 酶的固定化方法,載體結(jié)合法,交聯(lián)法,包埋法,物理吸附,共價(jià)結(jié)合,離子結(jié)合,酶的固定化,脂質(zhì)體,凝膠型,微囊型,,熱處理法,原理 ： 通過(guò)氫鍵、疏水作用和π-電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶性載體上。制備方法: a. 靜態(tài)法 (static procedure) b. 電沉積法 (electrodepo

12、sition procedure) c. 混和振搖裝載法 (mixing or shaking bath loading process) d. 反應(yīng)器裝載法 (reactor loading process),載體結(jié)合法,（1）物理吸附法,常用載體,a. 無(wú)機(jī)吸附劑：硅藻土、硅膠、氧化鋁、磷酸鈣膠、微孔玻璃、羥基磷灰石、活性炭等。無(wú)機(jī)吸附劑的吸附容量一般很低，多在1mg蛋白/g吸附劑。,b. 有機(jī)吸附劑：纖維素

13、、膠原、火棉膠等。有機(jī)吸附劑的吸附容量一般較高，如火棉膠膜吸附木瓜蛋白酶、堿性磷酸酯酶等，吸附容量為70mg蛋白/cm2膜。,優(yōu)點(diǎn) ① 活性中心不易被破壞，高級(jí)結(jié)構(gòu)保持完整； ② 操作簡(jiǎn)單，固定化和純化過(guò)程可能同時(shí)實(shí)現(xiàn)； ③ 酶失活后載體仍可再生。 缺點(diǎn) ① 最適吸附酶量無(wú)規(guī)律可循，吸附量與酶活力不一定呈平行關(guān)系； ② 酶與載體結(jié)合力不強(qiáng)，酶易于脫落，導(dǎo)致酶活下降并污染產(chǎn)物。,物理吸附

14、法固定化酶舉例,,原理：酶通過(guò)離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體上。載體： 陰離子交換劑：如二乙基氨基乙基(DEAE)-纖維素、混合胺類(lèi)-纖維素、四乙氨基乙基(TEAE) -纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等。 陽(yáng)離子交換劑：如羧甲基(CM)-纖維素、纖維素檸檬酸鹽、IR-200、Dowex-50等。,(2) 離子結(jié)合法,,,,制備方法 在一定pH、溫度、離子強(qiáng)度等條件下 ① 將酶液與載體混和攪拌數(shù)小時(shí) ②

15、將酶液緩慢流過(guò)處理好的離子交換柱,優(yōu)點(diǎn)： ① 操作簡(jiǎn)單，處理?xiàng)l件溫和。 ② 酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞。 ③ 吸附容量大。缺點(diǎn)： ① 載體和酶的結(jié)合力弱，易受緩沖液種類(lèi)或pH的影響。 ② 離子強(qiáng)度高時(shí)，酶易脫落。,①通過(guò)酶蛋白化學(xué)修飾來(lái)增加酶分子上電荷，能有效克服解吸附問(wèn)題。 例：用水溶性乙烯-順丁烯二酸酐共聚物共價(jià)修飾的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、可以用DEAE-纖維

16、素和DEAE-Sephadex載體有效的固定。這種固定幾乎是不可逆的吸附。 ②酶的吸附與解吸還與介質(zhì)中離子強(qiáng)度、pH、溫度、蛋白質(zhì)濃度及酶和載體的特性相關(guān)。 例：pH的變化影響到載體和酶的電荷，從而影響載體對(duì)酶的吸附。在等電點(diǎn)兩側(cè)(±1-2pH單位)吸附將明顯減少。 載體的表面積、多孔性及其預(yù)處理都影響對(duì)酶的吸附。,原理： 酶以共價(jià)鍵結(jié)合于載體上，即將酶分子上非活性部位功能

17、團(tuán)與載體表面反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)結(jié)合。酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)和載體表面上的功能基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵。,(3) 共價(jià)結(jié)合法,酶分子和載體連接的功能基團(tuán),① 酶蛋白N-端的氨基或Lys殘基的?-氨基。② 酶蛋白C-端的羧基、Asp殘基的β-羧基和Glu殘基γ-羧基。③ Cys殘基的巰基。④ Ser、 Thr 、 Tyr殘基的羥基。⑤ Phe和Tyr殘基的苯環(huán)。⑥ His殘基的咪唑基。⑦ Trp殘基的吲哚基。⑧ Arg殘基的胍基。,被偶聯(lián)

18、的基團(tuán)應(yīng)是酶活性的非必需基團(tuán)，否則將導(dǎo)致酶失去活性。,,纖維素瓊脂糖膠葡聚糖凝膠甲殼質(zhì)氨基酸共聚物甲基丙烯醇共聚物,常用載體,芳香氨基羥基羥甲基氨基,載體上的功能基團(tuán),酶分子上的非必需側(cè)鏈基團(tuán),氨基胍基羧基巰基咪唑基羥基,,,制備方法 載體上的功能基團(tuán)與酶分子上的側(cè)鏈基團(tuán)間不具有直接反應(yīng)的能力，因此在偶聯(lián)反應(yīng)前，需先進(jìn)行載體活化或接上雙功能試劑，在載體上引進(jìn)某種活潑基團(tuán)，然后此活潑基團(tuán)再與酶分子上某一基團(tuán)

19、反應(yīng)形成共價(jià)結(jié)合。,雙功能試劑（bifunctional reagent）,分子兩端各有一個(gè)相同或者不同的活性基團(tuán)，它們可與其他分子上的基團(tuán)發(fā)生共價(jià)結(jié)合而產(chǎn)生交聯(lián)作用的試劑。同型雙功能試劑異型雙功能試劑,,,,載體活化方法,1. 重氮法2. 疊氮法3. 溴化氰法4. 烷基化法,,① 重氮法(diazatitation)：適用于帶芳香氨基載體。載體先用亞硝酸鹽處理成重氮鹽衍生物，然后再在溫和的條件下和酶分子上相應(yīng)的基團(tuán)如酚羥

20、基、咪唑基或氨基直接進(jìn)行偶聯(lián)。,,,,,② 疊氮法（acylazide reaction）： 適用于帶羥基、羧甲基載體，如CM-纖維素、葡聚糖、聚氨基酸、乙烯-順丁烯二酸酐共聚物等。以羧甲基纖維素為例，可在酸等作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榀B氮衍生物，再與酶的氨基、羥基、酚羥基或巰基反應(yīng)。,,,,,,③ 溴化氰法（cyanogen bromide reaction）：適用于帶羥基的載體如纖維素、葡聚糖和瓊脂糖等。在堿性條件下載體羥基和溴化氰反應(yīng)生

21、成極活潑的亞氨碳酸基，它在弱堿中可直接和酶的氨基進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)。,,,,④ 烷基化法（alkylation reaction）： 適用于含羥基的載體。 堿性條件下和三氯均三嗪等反應(yīng)，引入活潑的鹵素后能直接與酶的氨基、羥基或巰基等偶聯(lián)。,,,,優(yōu)點(diǎn)： 酶與載體結(jié)合牢固，穩(wěn)定性好，不易脫落。 缺點(diǎn)： ① 載體需要活化，操作復(fù)雜； ② 反應(yīng)條件苛刻，反應(yīng)較為劇烈； ③ 共價(jià)結(jié)合

22、可能影響酶的空間構(gòu)象，進(jìn)而影響酶的催化活性或產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)。,共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)一般比較激烈，為了減少酶在偶聯(lián)過(guò)程中失效，應(yīng)采取怎樣的保護(hù)措施？,共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)中的保護(hù)措施,① 選擇適宜的固定化方法與相應(yīng)的載體。② 嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，提高反應(yīng)的專(zhuān)一性。③ 應(yīng)用可逆抑制劑或底物，封閉或牽制酶的活性中心與必需基團(tuán)，避免試劑影響酶的活性構(gòu)型和相應(yīng)基團(tuán)。如：在進(jìn)行腺苷三磷酸酶(ATPase)固定化時(shí)，可先用對(duì)羥基汞苯甲酸(PHMB) 保護(hù)巰基，

23、然后通過(guò)疊氮反應(yīng)將酶偶聯(lián)于羧甲基纖維素上，完成固定化后，再用還原劑使-SH活化，可得到高活性的固定化酶。,,交聯(lián)法,借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶 特點(diǎn)：共價(jià)鍵、不使用載體。 雙功能試劑：戊二醛、己二胺等。,,第一篇報(bào)道：戊二醛交聯(lián)羧肽酶，得到一種分子間交聯(lián)的固定化酶,,,,,酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián)（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分

24、子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶,共同點(diǎn)：均利用共價(jià)鍵結(jié)合不同之處：交聯(lián)法不使用載體,,,酶,優(yōu)點(diǎn): 結(jié)合牢固，可以長(zhǎng)時(shí)間使用缺點(diǎn) ① 因交聯(lián)反應(yīng)激烈，酶分子多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，酶活損失大； ② 顆粒較小，使用不便,向酶溶液中加入輔助蛋白的交聯(lián)過(guò)程，酶活回收率和機(jī)械強(qiáng)度較交聯(lián)酶法高。 用雙功能試劑使惰性蛋白與酶共交聯(lián)：酶在交聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中因化學(xué)修飾而引起失活，或因得到的酶量有限時(shí)，以一些輔助蛋白，如牛血清白

25、蛋白、明膠、膠原、抗體等與酶一起進(jìn)行交聯(lián)。解決方法2：降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時(shí)間,解決方法1：酶與輔助蛋白交聯(lián),先使用明膠（蛋白質(zhì)）包埋后，再用戊二醛交聯(lián)；先用尼龍（聚酰胺類(lèi)）膜或活性炭、Fe2O3等吸附后，再交聯(lián)。,解決方法3：與吸附法或包埋法聯(lián)合使用,,熱處理法,將含酶細(xì)胞在一定溫度下加熱處理一段時(shí)間，使酶固定在菌體內(nèi)而制備得到固定化菌體（死細(xì)胞）適用：熱穩(wěn)定性好的酶雙重固定化：與交聯(lián)法或其他固定化方法聯(lián)用,,原理：將聚

26、合物單體與酶溶液混合，再借助于聚合促進(jìn)劑(包括交聯(lián)劑)的作用進(jìn)行聚合，酶被包埋在聚合物中以達(dá)到固定化。類(lèi)型：主要有凝膠包埋、半透膜包埋、脂質(zhì)體包埋。,包埋法,1. 凝膠包埋 (gel entrapment) ① 常用凝膠,,天然膠：瓊脂、海藻酸鈣膠、角叉菜膠、明膠,合成膠：聚丙烯酰胺凝膠、光交聯(lián)樹(shù)脂,② 制備方法,以天然膠為載體（強(qiáng)度差）：先將天然物溶于含水介質(zhì)，然后再與酶液混和，最后使之膠化，制成膠包埋的固定化酶。

27、如：膠原可以添加丁醇；角叉菜膠可以添加KCl，然后冷卻；海藻酸可添加CaCl2，使之以膠的形式沉淀下來(lái)。 以合成膠為載體（易失活）：先將酶和丙烯酰胺單體分散于水介質(zhì)中，然后加入N,N’-甲叉雙丙烯酰胺聚合，酶即包埋于形成的聚丙烯酰胺凝膠中。,海藻酸鈉包埋胰蛋白酶步驟,凝膠孔徑應(yīng)小于酶分子直徑，因而不適用于大分子底物或大分子產(chǎn)物的酶類(lèi)的固定化,將酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊內(nèi)。它使酶存在于類(lèi)似細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中，可以防止酶的脫落

28、，防止微囊外環(huán)境直接接觸，從而增加了酶的穩(wěn)定性。同時(shí)，小分子底物能通過(guò)膜與酶作用，小分子產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)散而輸出。,2. 半透膜包埋法 (microencapsulation),,,乳化分散：取含有酶和親水性單體的水溶液，在不溶于水的有機(jī)溶媒中充分乳化。,表面聚合：將含有疏水性單體的有機(jī)溶媒加入到上述乳化液中，發(fā)生聚合反應(yīng)，生成的薄膜把酶包圍起來(lái)形成微型膠囊球。,1,清洗：反應(yīng)完成后，用有機(jī)溶劑洗去未反應(yīng)的剩余單體。,,,,,,,微囊,酶液滴,

29、,例：尼龍膜界面聚合包埋,酶+己二胺(水) +庚二酰氯 (氯仿) 混合  乳化，二種單體(己二胺和庚二酰氯) 在水相、有機(jī)相交界處聚合 形成包埋酶的尼龍膜珠粒 Tween 20破乳化，得到微囊包埋酶,,,,,,,,原理：在酶

30、的水溶液中添加表面活性劑，使之乳化形成液膜達(dá)到包埋的目的。表面活性劑(surfactant)：具有固定的親水親油基團(tuán)，在溶液的表面能定向排列，并能使表面張力顯著下降的物質(zhì)。該法不含化學(xué)反應(yīng)，簡(jiǎn)便，而且固定化是可逆的，但有滲漏的可能性。,表面活性劑乳化液膜法：,缺點(diǎn)：反應(yīng)條件要求高，制備成本也較高。,微囊直徑幾微米～幾百微米，比表面積大，物質(zhì)交換迅速低分子底物可以自由通過(guò)并進(jìn)入微囊內(nèi)，與酶反應(yīng)后的生成物被排除在微囊外酶本身是高分子

31、物質(zhì)不能通過(guò)微囊而被留在微囊中外部的蛋白分解酶、抗體等高分子物質(zhì)也無(wú)法進(jìn)入微囊內(nèi),優(yōu)點(diǎn):,將酶包埋于脂質(zhì)體(Liposome)中 脂質(zhì)體：具有脂雙層結(jié)構(gòu)和一定包囊空間的微球體。 特點(diǎn)： 具有一定的機(jī)械性能，能定向?qū)⒚傅缺话飻y帶到體內(nèi)特定部位，然后將被包裹物質(zhì)釋放。因此，其在藥物應(yīng)用方面受到重視。,3. 脂質(zhì)體（Liposome）包埋法,包埋法是目前應(yīng)用最多的一種較理想的方法，與其它固定化方法相比：優(yōu)點(diǎn)：不與酶

32、蛋白氨基酸殘基反應(yīng)，很少改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，酶活回收率高。缺點(diǎn)：只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。,,,,,,,用,,,微膠囊,,各種固定化方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較,二、固定化酶的性質(zhì) 影響酶催化活性的因素： 1. 構(gòu)象改變和立體屏蔽 2. 分配效應(yīng)和擴(kuò)散限制效應(yīng),（1）酶的活力,一般下降解決辦法：考慮相應(yīng)的固定化過(guò)程可能對(duì)酶的影響，避免損害酶的活性中心，有時(shí)在固定化反應(yīng)體系中會(huì)加入抑制劑、底物或產(chǎn)物以保護(hù)酶的活性中心。例：乳糖

33、酶的固定化就采用在其抑制劑葡萄糖-?-內(nèi)酯存在下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠的包埋，如此可獲得高活力的固定化乳糖酶。,（2）酶的穩(wěn)定性,一般提高原因：①固定化增加了酶活性構(gòu)象的牢固程度， 可防止酶分子伸展變形。②抑制酶的自身降解。③固定化部分阻擋了外界不利因素對(duì)酶的侵襲。,對(duì)熱的穩(wěn)定性提高，可以耐受較高的溫度,A固定化酶,B游離酶,如：氨基?；福?0℃，15分鐘，酶失去活性。而固定化后， 70℃，15分鐘，有>80%活性。,對(duì)蛋

34、白酶水解作用穩(wěn)定性增強(qiáng),對(duì)變性劑作用的穩(wěn)定性提高,保藏穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性提高 天然胰凝乳蛋白酶在pH 4.1，4℃保存4個(gè)月，殘留活力僅為原活力的2%。偶聯(lián)于瓊脂糖后，在同樣條件下，卻可保存82%的活力，有利于運(yùn)輸、貯存和重復(fù)使用。,（3）酶的最適溫度,最適溫度與酶穩(wěn)定性有關(guān)：多數(shù)酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升（有例外）。,例：用重氮法制備的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最適溫度比游離酶高5～10℃；以共價(jià)結(jié)合法固定化

35、的色氨酸酶，其最適溫度比游離酶高5～15℃。,同種酶，采用不同的方法或不同載體固定化后，其最適溫度可能不同。 如：氨基?；赣肈EAE—葡聚糖凝膠經(jīng)離子鍵結(jié)合法固定化后，其最適溫度(72℃)比游離酶的最適溫度(60℃)提高12℃；用DEAE—纖維素固定化，其最適溫度(67℃)比游離酶提高7℃；用烷基化法固定化的氨基?；?，其最適溫度卻比游離酶則有所降低。,（4）酶的最適pH值,酶固定化后，對(duì)底物 作用的最適pH和酶—

36、 pH曲線常發(fā)生偏移原因：微環(huán)境表面電荷 性質(zhì)的影響,pH對(duì)固定化前后天冬酰胺酶活力的影響,,,帶負(fù)電荷的載體，固定化酶最適pH值比游離酶的高,① 載體的帶電性質(zhì)對(duì)最適pH的影響,帶正電荷的載體，固定化酶最適pH值比游離酶的低,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,H+,H+,H+,H+,H+,H+,H+,偏酸微環(huán)境,OH-,OH-,OH-,OH-,OH-,OH-,H+,H+,大環(huán)境偏堿,酶,,不帶電荷的

37、載體，固定化酶最適pH值一般不變,② 產(chǎn)物酸堿性對(duì)最適pH值的影響,酸性: 固定化酶的最適pH值比游離酶的高 堿性: 固定化酶的最適pH值比游離酶的低 中性: 固定化酶的最適pH值一般不變 原因: 載體障礙產(chǎn)物的擴(kuò)散,固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km隨載體的帶電性能變化。 固定化載體與底物電荷相反，固定化酶的表觀Km值降低。 固定化載體與底物電荷相同，固定化酶的表觀Km值增加。,（5）酶的動(dòng)力學(xué)特征,（6）酶的底物特異性,與底物分

38、子量的大小有關(guān) 作用于低分子量底物的酶，沒(méi)有明顯變化 既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，往往會(huì)發(fā)生變化。 如：固定在羧甲基纖維素上的胰蛋白酶，對(duì)二肽或多肽的作用保持不變，而對(duì)酶蛋白的作用僅為游離酶的3%左右 原因：載體的空間位阻作用,氨基酸的分類(lèi),脂肪族氨基酸：包括一氨基一羧基酸、一氨基二羧基酸及其酰胺衍生物、二氨基一羧基酸芳香族氨基酸雜環(huán)族氨基酸雜環(huán)亞氨基酸,一氨基一羧基酸,,,,,,一氨基二羧基酸及其酰胺