第五章--植物細胞工程制藥

1、第五章 植物細胞工程制藥,5.1 概述5.2 植物細胞的形態(tài)和生理特性5.3 植物細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)5.4 影響植物次級代謝產(chǎn)物累積的因素5.5 植物細胞培養(yǎng)的生物反應器5.6 進展與展望5.7 植物生物轉(zhuǎn)化與生物制藥,5.1 概述,高等植物次級代謝產(chǎn)物極其豐富多樣，除藥用之外，許多次級代謝產(chǎn)物還是食品、化工和農(nóng)業(yè)化學的重要原料。人們通過研究，一方面通過化學合成的方法來生產(chǎn)，另一方面通過植物細胞培養(yǎng)方法來生產(chǎn)。目前已經(jīng)

2、研究過的近300種植物細胞培養(yǎng)物可以生產(chǎn)400多種人們感興趣的成分。,5.1.1 基本概念,植物組織和細胞培養(yǎng)：是指在無菌和人工控制的營養(yǎng)（培養(yǎng)基）及環(huán)境條件（光照、溫度等）下，研究植物的細胞、組織和器官以及控制其生長發(fā)育的技術(shù)。,幼苗及較大植株的培養(yǎng)，即為植物培養(yǎng)（plant culture）；從植物各種器官的外植體增殖而形成的愈傷組織的培養(yǎng)叫做愈傷組織培養(yǎng)（callus culture）；能夠保持較好分散性的離體細胞或較小細胞團

3、的液體培養(yǎng)，稱為懸浮培養(yǎng)（suspension culture）；離體器官的培養(yǎng)，如莖尖、根尖、葉片、花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟果實的培養(yǎng)，稱為器官培養(yǎng)（organ culture）；未成熟或成熟的胚胎的離體培養(yǎng)，則稱為胚胎培養(yǎng)（embryo culture）。,植物無菌培養(yǎng)技術(shù)分類,懸浮培養(yǎng),是指在液體培養(yǎng)基中，能夠保持良好分散性的細胞和小的細胞聚集體的培養(yǎng)。在此培養(yǎng)條件下組織化水平較低。,細胞培養(yǎng),是指利用

4、單個細胞進行液體或固體培養(yǎng)，誘導其增殖及分化。其目的是為了得到單細胞無性繁殖系。,分生組織培養(yǎng)（meristem culture）,又稱生長錐培養(yǎng)，是指在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)莖端分生組織細胞。分生組織，如莖尖分生組織的部位僅限于頂端圓錐區(qū)，其長度不超過0.1mm。研究表明，通過組織培養(yǎng)技術(shù)進行植物的快速繁殖試驗時往往并沒有利用這么小的外植體，而是利用較大的莖尖組織，通常包括1~2個葉原基。,外植體（explant）,是指用于植物組織

5、（細胞）培養(yǎng)的器官或組織（的切段），植物的各部位如根、莖、葉、花、果、穗、胚珠、胚乳、花藥和花粉等均可作為外植體進行組織培養(yǎng)。,器官形成（organogenesis）,是指在組織培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)物中芽、根或花等器官的分化與形成?；蛘咴谙刃纬傻男「垦杆傩纬捎鷤M織，然后再形成芽；或者在不同部位分別形成芽或根之后，再形成維管組織而將二者連成一個軸，最后形成小植株。如果培養(yǎng)過程中小植株的發(fā)生途徑與正常的受精卵發(fā)育方式極為近似時，通常稱為

6、胚胎形成（embryogenesis）。當在體細胞或花藥培養(yǎng)中培養(yǎng)物是小孢子這樣的單倍體細胞，其所形成的胚胎結(jié)構(gòu)叫做“胚狀體”（embryoid， or embryo-like）或“不定胚”（adventitious embryo）。,無性繁殖系,無性繁殖系（clone）又叫克隆，是指使用母體培養(yǎng)物反復進行繼代培養(yǎng)時，通過同種外植體而獲得越來越多的無性繁殖后代而言，如根無性系、組織無性系、懸浮培養(yǎng)物無性系等。在上述無性系的培養(yǎng)中

7、，有時其局部的組織無論在結(jié)構(gòu)、生長速度以及顏色方面都表現(xiàn)出明顯的區(qū)別，如繼續(xù)進行選擇培養(yǎng)，則從同一無性系可分離形成二個或多個不同的系列，該系列稱為“無性系的變異體”（clonal variant）。,突變體,細胞本身發(fā)生遺傳變異或應用誘變處理發(fā)生的遺傳變異所得的新細胞，即為突變體（mutant）。由單細胞形成的無性系稱為“單細胞無性系”；如果這種單細胞無性系是從同一組織分離得到的，并彼此不同時，叫做“單細胞變異體”。,繼代培養(yǎng),由最

8、初的外植體上切下的新增殖的組織，培養(yǎng)一代稱為“第一代培養(yǎng)”。連續(xù)多代的培養(yǎng)即為“繼代培養(yǎng)”（subculture），又稱“連續(xù)培養(yǎng)”。但習慣上“連續(xù)培養(yǎng)”一詞多用于不斷加入新的培養(yǎng)基，并連續(xù)收集培養(yǎng)物以保持平衡而進行的長期不轉(zhuǎn)移的懸浮培養(yǎng)。,次級代謝和次級代謝產(chǎn)物,人們把除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白質(zhì)及糖類（這些成分通常稱為初級代謝產(chǎn)物）以外，具有如下特征的成分稱為次級代謝產(chǎn)物：①有明顯的分類學區(qū)域界限；②其合成需在一定的條

9、件下才能發(fā)生；③缺乏明確的生理功能；④是生命的多余成分。現(xiàn)代定義：次級代謝作用是特殊蛋白質(zhì)內(nèi)源化合物的合成、代謝及分解作用的綜合體現(xiàn)。上述作用的結(jié)果導致了次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，如生物堿、黃酮體、萜類、有機酸、木質(zhì)素等。,5.1.2 植物細胞培養(yǎng)發(fā)展簡史,19世紀上半葉，Schleiden和Schwann提出了細胞學說；20世紀初，德國著名植物學家Haber landt依據(jù)細胞理論，首次提出了高等植物的器官和組織可以不斷分割，直至單個細胞

10、的觀點；20世紀20年代初至30年代，在胚胎培養(yǎng)和器官培養(yǎng)領域中取得了一些成果。Hanning首次在無機鹽溶液及有機營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基上成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚，觀察到離體胚均能正常發(fā)育，同時發(fā)現(xiàn)有促進提早萌發(fā)成苗的事實。自此植物器官與營養(yǎng)需求之間關(guān)系研究、原生質(zhì)體、培養(yǎng)基以及培養(yǎng)方法的研究獲得了高度重視，基因工程技術(shù)也被用于植物次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)中。,5.2 植物細胞的形態(tài)和生理特性,5.2.1 植物細胞的形態(tài),植物細胞的形態(tài)多

11、種多樣，隨植物種類、存在部位和功能的不同而異。游離的或排列疏松的薄壁細胞多呈球形、類圓形和橢圓形；排列緊密的細胞多呈角形；具有支持作用的細胞，細胞壁常增厚，呈類圓形、紡錘形等；具有輸導作用的細胞則多呈管狀。植物細胞大小不一。植物基本組織細胞體積較大，種子植物薄壁細胞的直徑在20~100微米之間；儲藏組織細胞的直徑可達1 mm。苧麻纖維一般為200 mm，有的可達500 mm以上。最長的細胞是無節(jié)乳管，長達數(shù)米至數(shù)十米不等。,5.2.

12、2 植物細胞結(jié)構(gòu)特征,根據(jù)典型細胞核的有無可將生物細胞分為原核細胞（prokaryotic cell）和真核細胞（eukaryotic cell）。真核細胞有典型的、為雙層膜所包被著的細胞核，原核細胞中只有類核（nucleoid）。類核沒有核膜包被，常常只有一條DNA，其周圍即為細胞質(zhì)。高等植物的細胞均為真核細胞。與動物細胞及微生物細胞相比，植物細胞有3個特點，即具有細胞壁、液泡和質(zhì)體（如葉綠體）。,5.2.3 細胞后含物和生理活

13、性物質(zhì),細胞中除含有生命的原生質(zhì)體外，還有許多非生命的物質(zhì)，它們均為細胞代謝過程中的產(chǎn)物。后含物：系儲藏物質(zhì)或廢棄物質(zhì)，分布于液泡內(nèi)，如糖類（saccharide）、鹽類（salts）、生物堿、苷、有機酸、揮發(fā)油等；生理活性物質(zhì)：對細胞內(nèi)生化代謝和生理活動起著調(diào)節(jié)作用，含量雖少，但其生理作用卻非常重要，如酶、維生素、植物激素和抗生素等。,生物堿（alkaloide）是一類含氮的有機化合物，廣布于植物界。含生物堿較多的植物科有：茄科

14、、罌粟科、小檗科、豆科、夾竹桃科等。按照植物化學分類學的觀點，親緣關(guān)系相近的植物，常含有化學結(jié)構(gòu)相似的成分。此外，一種植物所含的同一類成分中也經(jīng)常存在多種化學成分，如人參中含有幾十種人參皂苷。它們均屬于三萜皂苷類成分。中草藥中含有多種生物堿，如麻黃堿、咖啡、阿托品、喹啉、黃連素等，其生理活性都很強。,細胞后含物,糖苷類糖苷（glucosides）,是指某些有機化合物和糖經(jīng)苷鍵結(jié)合而成的化合物，例如黃酮苷是黃酮苷元和糖連接而成。很多

15、糖苷類化合物對疾病都有很好的治療作用，如洋地黃毒苷有強心作用；大黃中的蒽醌苷有強烈的瀉下作用；紫草中紫草寧是紫草中蒽醌類化合物的總稱，除作為天然色素（如口紅）外，尚具有很好的抗癌活性。,揮發(fā)油（volatile oil）,是一類具有芳香氣味，在常溫下易于揮發(fā)的油類。在傘形科、姜科、唇形科等植物中多有分布。很多揮發(fā)油可作藥用，如薄荷油、丁香油、桉油等。,有機酸（organic acids）,是糖類代謝的中間產(chǎn)物。植物果實中酸味以及細胞液的

16、酸性反應，主要是由于有機酸的存在。常見的植物有機酸有：蘋果酸、檸檬酸、水楊酸、酒石酸等。,生理活性物質(zhì),是一類對細胞內(nèi)的生化反應和生理活動起調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)的總稱。包括酶、維生素、植物激素和抗生素等。酶（enzymes）是一種有機催化劑。酶反應一般在常溫、常壓、中性水溶液中進行，高溫、強酸、強堿和某些重金屬離子，會使其失活。,維生素,是一類復雜的有機物，常參與酶的形成，對植物的生長、呼吸和物質(zhì)代謝有調(diào)節(jié)作用，如對難以生根的植物，用

17、維生素B12處理后可促進不定根的生長。,植物激素,是植物細胞原生質(zhì)體產(chǎn)生的一類復雜的調(diào)節(jié)代謝的有機物質(zhì)，對生理過程（如細胞分裂和繁殖）產(chǎn)生作用，其量雖微，但作用甚大。,抗生素和植物殺菌素,是由微生物（如某些菌類植物）產(chǎn)生的能殺死或抑制某些微生物生長的物質(zhì)，如青霉素、鏈霉素等。高等植物如蔥、蒜、辣椒、蘿卜等也能產(chǎn)生殺菌的物質(zhì)，稱為植物殺菌素（plant fungicidin）。,5.2.4 植物培養(yǎng)細胞的生理特性,,延遲期（lag p

18、hase）,植物培養(yǎng)細胞不同生長階段的持續(xù)時間及特征。細胞分裂的初始期和最大生長期之間，其持續(xù)時間取決于培養(yǎng)前的條件、時期和培養(yǎng)基性質(zhì)，其特征是細胞數(shù)量、干重近乎恒定，細胞壁厚度達最大；高RNA含量；高蛋白質(zhì)合成能力；高聚核糖體含量；有絲分裂加速；增加細胞的細胞質(zhì)部分,加速期（acceleration phase）,細胞最大生長期和最大細胞濃度，最佳DNA濃度和蛋白質(zhì)累積率，持續(xù)時間3~4代，其特征為常數(shù)：干重 增加：細胞數(shù)、DN

19、A和蛋白質(zhì)濃度 減少：有絲分裂活性、RNA含量和蛋白質(zhì)合成能力、增加細胞鮮種、干重及RNA酶活性。,對數(shù)期（log phase）：介于最大生長率和蛋白質(zhì)合成完全停止期之間 ，其特征為蛋白質(zhì)合成能力減退；變化：聚核糖體濃度向有利于單核糖體和寡核糖體形成的方向減少。穩(wěn)定期（stationary phase）：細胞數(shù)穩(wěn)定， 其特征為細胞高液泡化、極度脆弱、高度分化，有機化合物的濃度高。,植物細胞培養(yǎng)存在問題,植物培養(yǎng)細胞重量的增加主

20、要取決于對數(shù)期，而次級代謝產(chǎn)物的累積則主要在穩(wěn)定期完成。當然植物細胞與哺乳動物細胞及微生物細胞有很多的不容，并由此導致了一系列生理生化等方面的差異，比如混合與傳質(zhì)等。就植物細胞而言，它們很少以單一細胞懸浮生長，而多以非均相集合體的細胞團形式存在。根據(jù)細胞系的來源、培養(yǎng)基及培養(yǎng)時間等的不同，細胞團的細胞數(shù)目在2~200 之間，直徑為2 mm左右。,細胞團產(chǎn)生原因：（1）細胞分裂之后沒有進行細胞分離；（2）在間歇培養(yǎng)過程中細胞處于對數(shù)生長后

21、期時，開始分泌粘多糖和蛋白質(zhì)，或者以其它形式形成粘性表面，從而形成細胞團。植物細胞形態(tài)上的另一特性，就是其纖維素細胞壁使得其外骨架相當脆弱，表現(xiàn)為抗張力強度大，抗剪切能力小，故傳統(tǒng)的攪拌式生物反應器容易損壞植物細胞的細胞壁。再者，植物細胞培養(yǎng)基黏度比較高，且培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量呈指數(shù)上升。,所有的植物都是好氣性的，因此培養(yǎng)過程中需要不斷地供氧。但是，與微生物細胞相反，它并不需要很高的氣液傳質(zhì)速率，而是要控制供氧量，以保持較低的溶

22、氧水平。此外，大多數(shù)植物細胞液體培養(yǎng)的pH為5~7，在此pH水平，通氣速率過高會驅(qū)除二氧化碳而抑制細胞生長，這個問題可通過在通氣過程中加入一定濃度的二氧化碳來解決。注意光照的影響。,植物細胞液體培養(yǎng)過程中的泡沫問題不象微生物細胞培養(yǎng)時那么嚴重，泡沫的性質(zhì)也不同。氣泡比微生物培養(yǎng)系統(tǒng)中的大，而且由于其含有蛋白質(zhì)或粘多糖，黏度較大，細胞極易被包埋在泡沫中，并從循環(huán)的營養(yǎng)液中帶出來，這就造成了非均相培養(yǎng)，通常需要采用化學或機械的方法加以控制，

23、否則，隨著泡沫和細胞數(shù)量的增加，混合和培養(yǎng)過程的穩(wěn)定性就要受到影響。,在植物細胞液體培養(yǎng)過程中，細胞可能會黏附于培養(yǎng)的反應器壁、電極或擋板的表面上。細胞對表面的黏附及其在器壁上的生長特性，是人們目前正在研究的重點課題之一。通過改變培養(yǎng)基中某些離子的成分，可使表面吸附問題得到一定程度的改善。,5.3 植物細胞培養(yǎng)基本技術(shù),5.3.1 植物材料準備,用于植物組織培養(yǎng)的外植體，必須是無雜菌材料。微生物在接觸培養(yǎng)基時會大量繁殖，抑制培養(yǎng)物的生長

24、，因此需滅菌處理。許多化學試劑均能作為表面滅菌劑使用，原則上應盡可能選擇那些滅菌后易于除去或容易分解的時間試劑。滅菌劑的選擇和處理時間的長短取決于所用材料對試劑的敏感性。對滅菌劑敏感的外植體的滅菌時間不宜過長；而不敏感的，滅菌時間則可適當延長。經(jīng)常使用的滅菌劑如下表。,常用滅菌劑效果比較,植物不同組織（器官）的滅菌時間和步驟,植物材料滅菌后，即可進行培養(yǎng)。接種的外植體的形狀和大小要根據(jù)試驗目的及具體情況而定。當然，如果所用外植體細胞

25、多時，得到愈傷組織的機會必然也多。如要定量研究愈傷組織，則不僅外植體的大小要一致，而且其形狀及組織部位也應基本類似。進行這類培養(yǎng)研究常常選用較大材料，如人參、胡蘿卜或甜菜的貯藏根、馬鈴薯的塊莖等。,5.3.2 培養(yǎng)基組成,培養(yǎng)基實際上是植物離體器官、組織或細胞等的無菌土壤，其特點是營養(yǎng)成分的可調(diào)控性。植物組織和細胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基種類較多，但通常都含有無機鹽、碳源、有機氮源、植物生長激素、維生素等化學成分。有商品化的培養(yǎng)基可以購買。,

26、無機鹽,基本培養(yǎng)基是由各種濃度的無機鹽溶液組成的，這些無機鹽又有“大量元素”和“微量元素”之分。大量元素是指使用濃度大于30 mg/L時的無機元素，包括N、S、P、K、Mg、Ca、Cl和鈉，而微量元素是指濃度低于30mg/L的無機元素，如Fe、B、Mn、I和Mo，以及極微量的Cu和Zn。某些情況下，還可加入Ni、Co和Al。這些微量元素作為輔因子或?qū)γ负铣啥?，都是必須的，如鎳對脲酶的合成就是至關(guān)重要的。,碳源,植物細胞培養(yǎng)物通常均為異

27、養(yǎng)細胞。因此人們經(jīng)常使用碳水化合物、肌醇作為碳源，有時也用甘油、乳糖和半乳糖等化合物。有些培養(yǎng)物還可通過同化二氧化碳而獲得所需的能量，此所謂光自養(yǎng)培養(yǎng)物。在某些情況下，培養(yǎng)基固化劑也可作為補充能量和碳源之用。此外，某些天然提取物對愈傷組織的誘導和培養(yǎng)也有重要意義，如椰子乳（椰子的液體胚乳），常用濃度為10%；也可用0.5%的酵母提取物或5%~10%的番茄汁等。,植物生長調(diào)節(jié)劑,植物激素是指植物代謝過程中形成的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在極低濃度（

28、<1 ?M）時即能調(diào)節(jié)植物的生育過程，并能從合成部位轉(zhuǎn)運到作用部位而發(fā)揮作用。植物激素只限于天然產(chǎn)生的調(diào)節(jié)物質(zhì)，到目前位置，已發(fā)現(xiàn)植物組織中可以形成5種植物激素，即生長素、分裂素、赤霉素、脫落酸和乙烯。植物生長調(diào)節(jié)劑既包括人工合成的具有生理活性的化合物，也包括一些天然的化合物以及植物激素。,有機氮源,多為蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物（如谷氨酰胺）或各種氨基酸。有機氮源對細胞的早期生長有利，氨基酸的加入主要是為了代替或增加氮源的供應，但應注意的是

29、蘇氨酸、甘氨酸和纈氨酸可通過滅活位于葉綠體和細胞質(zhì)上的谷氨酸合成酶而降低氮的利用，而精氨酸通常具有補償此滅活作用的能力。,維生素,植物細胞通常是維生素自養(yǎng)型的，但在大多數(shù)情況下，其自身合成的量均不能滿足植物細胞的需要，即使是光合成活性細胞或組織也是如此。故對大多數(shù)培養(yǎng)基而言，除了必需加入的B族維生素（如B1、B6和泛酸）外，通常還需加入一定量的生物素和肌醇，后者是構(gòu)成磷酸肌醇（細胞膜脂質(zhì)部分含磷酸肌醇2%~8%）極性端的部分。,5.3.

30、4 培養(yǎng)方法,按培養(yǎng)對象：原生質(zhì)體培養(yǎng)、單倍體細胞培養(yǎng)；按照培養(yǎng)基類型：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)；按培養(yǎng)方式：懸浮細胞培養(yǎng)、固定化細胞培養(yǎng)。,固體培養(yǎng),是在微生物培養(yǎng)方法的基礎上發(fā)展起來的。所謂固體培養(yǎng)系統(tǒng)實際上包括利用瓊脂作為支撐物的固體培養(yǎng)和固定化細胞培養(yǎng)。固體培養(yǎng)是在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，經(jīng)加熱溶解后，分別裝入培養(yǎng)用的容器中，冷卻后凝結(jié)成固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)的特點是簡便易行、所占空間小。但也有缺點，主要是不均衡現(xiàn)象。

31、常用的固化劑有瓊脂、藻酸鹽（alginate）、角叉藻聚糖（carrageenan）、明膠（gelatin）、羥乙基纖維素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅膠等。最常用的凝固劑是瓊脂，最適濃度0.6~1.0%。,溫度一般控制在25?1℃之間。有些植物材料在誘導愈傷組織時需要在黑暗條件下進行，但誘導愈傷組織的器官分化和其他材料的培養(yǎng)都需要光照。光照以每天16h為宜。由于植物組織在培養(yǎng)基上生長要不斷消耗營養(yǎng)、散失水分和累積代謝物，必將影響培養(yǎng)物的

32、進一步生長。因此外植體在培養(yǎng)三周左右必須轉(zhuǎn)換至新鮮培養(yǎng)基上，以保持正常生長。移換一次培養(yǎng)基稱一次繼代培養(yǎng)。一種外植體經(jīng)過一定次數(shù)的繼代培養(yǎng)，其培養(yǎng)物就可用于懸浮培養(yǎng)。,包括小規(guī)模的懸浮培養(yǎng)和大規(guī)模的成批培養(yǎng)、半連續(xù)和連續(xù)培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)：靜止和振蕩兩類。靜止液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)一樣，也具有簡便易行的特點，而且培養(yǎng)基還不會產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)濃度差的現(xiàn)象。振蕩液體培養(yǎng)，是使懸浮細胞在液體培養(yǎng)基中，并不斷振動下進行培養(yǎng)。這樣可以防止上述靜止培養(yǎng)

33、的許多缺點。通常培養(yǎng)基的體積約占容器體積的20%。,液體培養(yǎng),成批培養(yǎng)法,將培養(yǎng)基一次性地加入反應器，接種、培養(yǎng)一定時間后收獲細胞的操作方式稱為成批培養(yǎng)法。植物細胞培養(yǎng)過程中，次級代謝產(chǎn)物的大量累積往往發(fā)生在細胞生長的穩(wěn)定期，人們基于此原理設計了植物細胞的兩步培養(yǎng)法，即使用兩個生物反應器，第一個反應器用于細胞生物量的累積，第二個反應器用于次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。,半連續(xù)培養(yǎng)法：在反應器中投料和接種培養(yǎng)一段時間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)液

34、進行交換的培養(yǎng)方法稱為半連續(xù)培養(yǎng)法。連續(xù)培養(yǎng)法：利用連續(xù)培養(yǎng)反應器，在投料和接種培養(yǎng)一段時后，以一定速度連續(xù)采集細胞和培養(yǎng)液，并以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基以使細胞生長環(huán)境長期維持恒定的方法。,固定化培養(yǎng)法,植物次級代謝產(chǎn)物的累積主要在細胞生長的穩(wěn)定期，表明細胞成塊而趨于分化時，細胞塊中各個細胞處于一定理化梯度之下，此現(xiàn)象與完整植株類似，由此人們提出了植物細胞固定化培養(yǎng)技術(shù)。固定化培養(yǎng)采用的固定化反應器有網(wǎng)狀多孔板、尼龍網(wǎng)套和中空纖

35、維膜等多種類型，將細胞固定于尼龍?zhí)變?nèi)，或固定于中孔纖維反應器的膜表面，或固定于網(wǎng)狀多孔板上，放入培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，或連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液，進行連續(xù)培養(yǎng)及連續(xù)收集培養(yǎng)產(chǎn)物，也可通入凈化空氣以代替攪拌。優(yōu)點是細胞位置固定，易于獲得高密度細胞群體及維持細胞間的物理化學梯度，利于細胞組織化，易于控制條件。,5.4 影響植物次級代謝產(chǎn)物累積的因素,生物條件：外植體、季節(jié)、休眠、分化等；物理條件：溫度、光（光照時間、光強、光質(zhì)）、通氣（O2）、pH

36、和滲透壓等；化學條件：無機鹽（N、P、K等）、碳源、植物生長調(diào)節(jié)劑、維生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物質(zhì)、前體等；工業(yè)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)罐類型、通氣、攪拌和培養(yǎng)方法等。,因素包括,5.4.1 外植體,不同外植體的懸浮細胞培養(yǎng)物，其最大次級代謝產(chǎn)物的累積時間各異。同一化合物可以在不同外植體的不同生長階段中累積，有的次級代謝產(chǎn)物累積是在延遲期進行，有的則在加速期累積，當然也有的累積時間與細胞生長曲線同步，還有的則在穩(wěn)定期大量累積次級代謝產(chǎn)

37、物。,5.4.2 培養(yǎng)條件,接種和誘導：外植體的大小不僅影響所誘導的組織和細胞的生長，而且也關(guān)系到其次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力，如長春花培養(yǎng)物中蛇根堿的合成要求其外植體直徑在1~12 cm之間，在此條件下才能分泌噻吩類成分。次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率與外植體大小、細胞密度及營養(yǎng)成分密切相關(guān)，如在紫草的細胞培養(yǎng)中，當營養(yǎng)成分的供給為1400 mg/L時，細胞干重為2.8 g/L。然而，細胞生長率的增加有時會導致次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的降低。外植體的大小

38、可能是使某些次級代謝產(chǎn)物含量發(fā)生變化的原因之一，此類現(xiàn)象常見于一些高產(chǎn)細胞株經(jīng)繼代培養(yǎng)之后。前處理也可影響累積方式。,5.4.3 培養(yǎng)環(huán)境,基本培養(yǎng)基組成： 基本培養(yǎng)基的各種成分是愈傷組織和懸浮細胞培養(yǎng)的物質(zhì)基礎，尤其在穩(wěn)定期次級代謝產(chǎn)物累積時更是如此。①磷：②氮：③銅：碳源 ：碳源通常以光自養(yǎng)培養(yǎng)中的CO2或異養(yǎng)培養(yǎng)中的糖類兩種形式提供，其性質(zhì)和數(shù)量往往對培養(yǎng)細胞的生物量有很大的影響。CO2可以誘導某些特征反應，如在金蘋果的懸浮細

39、胞培養(yǎng)中，高濃度CO2可產(chǎn)生一種特有的蘋果香味。,,植物細胞培養(yǎng)中使用最多的碳源是糖類，對次級代謝產(chǎn)物的影響主要取決于所使用的糖類的種類及細胞次級代謝產(chǎn)物的生物合成過程。,植物生長調(diào)節(jié)劑,在植物細胞培養(yǎng)中起著非常重要的作用，這種作用有時可能是關(guān)鍵性的。但是植物材料和生理狀態(tài)的差異，無一定的規(guī)律可循，必須通過仔細的實驗觀察才能確定其合適的數(shù)量和種類。如Furuya在培養(yǎng)煙草細胞時發(fā)現(xiàn)，加入IAA時培養(yǎng)物中有尼古丁生成，但2，4-D存在時則

40、不合成該化合物。說明不同植物激素及其不同組合形式均可顯著影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。,O2和pH,O2 ：培養(yǎng)細胞生長過程需要維持其正常呼吸作用，懸浮細胞培養(yǎng)和固定化細胞培養(yǎng)時供氧方式有所不同，前者可采用攪拌和通氣方式，攪拌速度通常為120~160 r/min，過快易導致細胞破裂；后者僅能采用通氣方式，一般使用含5%CO2的潔凈空氣，通氣量應適當，過多或過少均影響細胞生長及次級代謝產(chǎn)物的合成。pH：一般來說，最有利于培養(yǎng)細胞生長的pH在5~6

41、之間。常用的培養(yǎng)基均具有一定的緩沖性質(zhì)，在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液的pH變化較小。,滲出物（exudates）,在細胞懸浮培養(yǎng)后期，培養(yǎng)液中常含有各種代謝產(chǎn)物，如某些初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物以及某些酸性物質(zhì)、醇類、水解蛋白或活性蛋白等。如落花生懸浮培養(yǎng)細胞培養(yǎng)的后期培養(yǎng)液中含有27種多肽成分。此外，培養(yǎng)細胞分泌產(chǎn)物的量也取決于培養(yǎng)物的發(fā)育階段，如在多葉羽扁豆懸浮細胞培養(yǎng)中，在活躍的生長期初期，酶的分泌量就達到了穩(wěn)定期的水平，爾后酶活性隨乙醇

42、量的增加而降低。次級代謝產(chǎn)物的累積往往在水解酶活性增加之前進行。,5.4.4 兩步培養(yǎng)法,培養(yǎng)基的組成是細胞生長和次級代謝產(chǎn)物的形成最直接、也是最重要的影響因素。為了得到最佳生長和最佳次級代謝產(chǎn)物，提出了兩步法。第一步主要使用適合細胞生長的培養(yǎng)基，稱為生長培養(yǎng)基（growth medium）第二步主要用適于次級代謝產(chǎn)物合成的培養(yǎng)基，稱為生產(chǎn)培養(yǎng)基。,,兩種培養(yǎng)基往往有較大的區(qū)別，前者是為了實現(xiàn)細胞的高生產(chǎn)率，后者通常具有較低含量的硝酸

43、鹽和磷酸鹽，并含有較低的糖份或較少的碳源。書中介紹了長春花細胞培養(yǎng)中生長培養(yǎng)基與生產(chǎn)培養(yǎng)基的區(qū)別主要為前者使用了肌醇及維生素類成分，而后者則不含上述成分，在生長調(diào)節(jié)劑的使用上，前者應用2，4-D刺激細胞生長，而后者加入6-BA以便利于次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。,溫度,培養(yǎng)物中次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的最佳溫度為20~28℃。在一定溫度（≤15 ℃ ）下，細胞不再生長，次級代謝產(chǎn)物也不再產(chǎn)生。但應該指出的是，在某些極端情況下（如30 ℃），細胞也能正常

44、生長。終產(chǎn)物和中間產(chǎn)物的累積，甚至與其生物合成直接相關(guān)的化合物，也并非需要相同的溫度。低溫對次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的影響類似于2，4-D的抑制作用。當培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)物正常生長所要求的溫度相差很大時，可引起某些應激效應以及對次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的激活作用。溫度的變化尚可引起產(chǎn)物類型在質(zhì)和量上的改變，個別情況下由于激活了新的生物合成途徑也可能產(chǎn)生新的代謝物質(zhì)。,攪拌頻率,植物培養(yǎng)細胞的產(chǎn)率與發(fā)酵罐的攪拌速度有關(guān)，具體表現(xiàn)在發(fā)酵液中的溶氧濃度和機械攪拌

45、對細胞所產(chǎn)生的剪切力上，如上述因素對海巴戟長方形細胞（累積蒽醌類成分）、產(chǎn)生甜菜苷（betanine）的甜菜（Beta vulgaris）細胞和累積蛇根堿的長春花細胞等的影響就非常明顯。但攪拌頻率也不宜過小，如低于28r/min時，次級代謝產(chǎn)物的生物合成反應就有可能發(fā)生反轉(zhuǎn)。,培養(yǎng)容器,植物培養(yǎng)細胞次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生可因為所用培養(yǎng)容器的大小和攪拌裝置的不同而得到不同的結(jié)果。如小規(guī)模實驗室培養(yǎng)所用的培養(yǎng)容器（50~500 ml）具有較高的

46、氧轉(zhuǎn)移率，通過簡單的定期攪拌，培養(yǎng)物的每個部位均可得到比大規(guī)模培養(yǎng)更好的氧供應。用于生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物反應器中的攪拌器對細胞產(chǎn)率可產(chǎn)生一定的影響，這些差異及由剪切力引起的不良影響可通過使用氣升式發(fā)酵罐或一個沿水平軸轉(zhuǎn)動的發(fā)酵罐而予以避免。但因為植物細胞生長和次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)過程是完全分離的，所以這對細胞生產(chǎn)過程會有不利影響。延長穩(wěn)定期就意味著延長培養(yǎng)時間，從而增加成本、增大污染機會等，可以通過兩步培養(yǎng)等方法解決。,光的影響,光照時間、光

47、質(zhì)和光強對次生代謝產(chǎn)物（如黃酮、黃酮醇、花色素苷、揮發(fā)油等）的累積都有一定影響。,5.5 植物細胞培養(yǎng)的生物反映器,要研制適合于高等植物細胞大量培養(yǎng)的生物反應器，首先應對植物細胞的特性有所了解。植物細胞的發(fā)酵培養(yǎng)借鑒了微生物發(fā)酵的經(jīng)驗，但植物細胞和微生物相比存在著很多差異：植物細胞的直徑為10 ?m~100 ?m，比細菌和真菌細胞大10~100倍；植物細胞的纖維素壁具有較差的抗剪切能力；植物細胞的呼吸率低，對氧的需求也低。此外，植物細胞

48、培養(yǎng)生物反應器的設計與各類植物細胞的不同生理特征和代謝方式有關(guān)，同時也與培養(yǎng)方式相聯(lián)系。,反應器的選擇取決于生產(chǎn)細胞的密度、通氣量以及所提供的營養(yǎng)成分的分散程度。根據(jù)通氣和攪拌系統(tǒng)的類型可將生物反應器分為以下幾類：搖瓶攪拌型生物反應器環(huán)流生物反應器和鼓泡塔生物反應器。,植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反應器,機械攪拌式生物反應器鼓泡塔生物反應器氣升式生物反應器轉(zhuǎn)鼓式生物反應器固定化細胞生物反應器,5.6 進展與展望,,5.6.1 誘

49、導子,在植物細胞培養(yǎng)中加入誘導子可以提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，并可促進產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。誘導子的作用隨誘導子種類的不同而異，如在紫杉醇的細胞工程研究中，Christen等向培養(yǎng)基中加入高壓滅活的殼囊孢菌菌絲體和青霉菌的孢子，或加入硫酸礬和3,4-二氯苯氧基三乙基胺等，可促進短葉紅豆杉的懸浮細胞生長，并分泌更多的紫杉醇。,誘導子,植物抗毒素（phytoalexins）是指在植物防御系統(tǒng)內(nèi)能對抗微生物進攻的某些次級代謝產(chǎn)物（根據(jù)其功能又

50、稱為“后感染防御物質(zhì)”）。盡管在有些情況下代謝產(chǎn)物可能會連續(xù)合成，但在另外一些情況下只有細胞被刺激時才能產(chǎn)生植物抗毒素，或僅在被誘導時其產(chǎn)量才能增加。觸發(fā)形成植物抗毒素信號的物質(zhì)稱為誘導子。從廣義上講，誘導子是能夠誘導植物細胞中一個反應，并形成特征性自身防御反應的分子。,誘導子的分類,一種是根據(jù)在細胞內(nèi)或細胞外形成而將其分為內(nèi)源性誘導子和外源性誘導子；另一種是根據(jù)其來源分為生物誘導子（biotic elicitors）和非生物誘導子

51、（abiotic elicitors），現(xiàn)多采用后者。生物誘導子是指植物體在防御過程中為對抗微生物感染而產(chǎn)生的物質(zhì)，主要包括分生孢子（conidia），降解細胞壁的酶類、細胞壁碎片、有機體產(chǎn)生的代謝物等成分。初生細胞壁中富含由半乳糖醛酸組成的多糖成分，1%的濃度就足以誘導植物產(chǎn)生抗毒素，但其活性一般低于外源性?-庚糖苷。非生物誘導子是指所有不是植物細胞中天然成分但又能觸發(fā)植物細胞形成抗毒素信號的物質(zhì)。生物誘導子和非生物誘導子在其量效關(guān)

52、系上也有區(qū)別。,誘導子類型,與所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物的類型沒有直接關(guān)系，各種生物合成途徑所必須的酶也并不是對酶個誘導子的刺激都產(chǎn)生反應，如在園歐芹懸浮細胞培養(yǎng)中，UV（非生物誘導子）對黃酮生物合成過程中所涉及的酶類有誘導作用，而在苯丙烷代謝中，只有生物誘導子才能與有關(guān)酶發(fā)生反應。,5.6.2 前體飼喂,是增加次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)率的重要方法。生物合成研究結(jié)果表明，次級代謝物的形成，依賴于3種主要原材料（結(jié)構(gòu)范圍，building block）的

53、供應，即：①莽草酸：屬芳香化合物，是芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的前體；②氨基酸：形成生物堿及肽類抗生素類，包括青霉素類和頭孢菌素類；③乙酸：是聚乙炔類、前列腺素類、大環(huán)抗生素類、多酚類、類異戊二烯等的前體。,5.6.3 兩相法培養(yǎng),基本出發(fā)點是在細胞外創(chuàng)造一個次級代謝產(chǎn)物的儲存單元。該培養(yǎng)方法可以加入固相或疏水液相，形成兩相培養(yǎng)系統(tǒng)，從而達到收集分泌物的目的。該法可減輕產(chǎn)物本身對細胞代謝的抑制作用，并可保護產(chǎn)物免受培養(yǎng)基中催

54、化酶或酸對產(chǎn)物的影響。此外，由于產(chǎn)物在固相或疏水液相中的積累簡化了下游處理過程。,兩相法培養(yǎng)系統(tǒng)須滿足條件,添加的固相（如樹脂）或液相對細胞無毒害作用，不影響細胞生長和產(chǎn)物的合成；產(chǎn)物易被固相吸附或被有機相溶解；兩相易分離；如為固相，不可吸附培養(yǎng)基中的添加成分，如植物生長調(diào)節(jié)劑、有機成分等。,5.6.4 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在次級產(chǎn)物生產(chǎn)中的應用,毛狀根和冠癭瘤培養(yǎng)：對雙子葉植物病原菌根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌發(fā)病機理的研究，發(fā)現(xiàn)了兩種農(nóng)

55、桿菌的原生質(zhì)體中，分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，大小約200 kb。植物遭受感染后，農(nóng)桿菌能將質(zhì)粒中的一段轉(zhuǎn)移DNA片段整合到植物細胞核的DNA基因編碼上，作為表現(xiàn)型，從被感染處長出冠癭瘤或毛狀根（hairy-root）。將冠癭瘤或毛狀根作為培養(yǎng)系統(tǒng)，可進行有機化合物的生產(chǎn)。轉(zhuǎn)基因植物與活性成分生產(chǎn),5.6.5 植物生物轉(zhuǎn)化與生物制藥,由于高等植物細胞中次生產(chǎn)物含量低，且不能或很難通過化學途徑合成。植物生物轉(zhuǎn)化,生物轉(zhuǎn)化,也稱生物催