輸血相關(guān)傳染病的檢測(cè)技術(shù)概述

1、輸血相關(guān)傳染病檢測(cè)技術(shù)概 述,甘肅省平?jīng)鍪兄行难緦?shí)驗(yàn)室 吳 宏 濤,輸血相關(guān)傳染病種類,病毒性肝炎 乙、丙、丁、庚型肝炎艾滋病梅毒巨細(xì)胞病毒EBV感染HTLV感染（美國(guó)、歐盟及我國(guó)的廈門血站開(kāi)展） 瘧疾弓形體病等,輸血相關(guān)傳染病檢測(cè)方法,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA*免疫熒光法IFA放射免疫法RIA免疫印跡法WB*重組免疫印跡法RIBA顆粒凝集實(shí)驗(yàn)PA病毒檢測(cè)VT病毒核酸檢測(cè)NAT*

2、,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA,建于1971年。開(kāi)創(chuàng)了運(yùn)用酶標(biāo)記免疫技術(shù)進(jìn)行液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測(cè)定，是檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的里程碑式的發(fā)展。特點(diǎn)：敏感性高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，即可測(cè)定抗原，也可測(cè)定抗體。類型：間接法，直接法，雙抗體夾心法，競(jìng)爭(zhēng)抑制法或競(jìng)爭(zhēng)法。,免疫熒光法IFA,熒光抗體技術(shù)熒光抗原技術(shù)原理： 以特異抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)，利用熒光素作為標(biāo)記物標(biāo)記已知抗原（或抗體），在一定條件下與被測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗體（或抗原）結(jié)合，形成抗原抗體

3、復(fù)合物，此時(shí)熒光素起示蹤物作用。再通過(guò)有紫外光源的熒光顯微鏡就可以辨認(rèn)出特異性抗原抗體復(fù)合物的存在。,放射免疫法RIA,一種用放射性同位素為標(biāo)記物的免疫學(xué)測(cè)定方法，具有很高的敏感性與特異性。其原理與ELISA大致相同，所不同的是用放射性同位素為標(biāo)記物而不是用酶為標(biāo)記物。,免疫印跡試驗(yàn)WB,又名蛋白印跡試驗(yàn)，其原理是在病毒裂解后將不同分子量的病毒蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯胺凝膠電泳（PAGE）分離后，經(jīng)過(guò)電轉(zhuǎn)移將凝膠上的蛋白條帶

4、轉(zhuǎn)移到位硝酸纖維素膜上，以此作為抗原進(jìn)行病毒特異性抗體檢測(cè)。,重組免疫印跡試驗(yàn)RIBA,原理：應(yīng)用重組蛋白或合成肽（而不是直接應(yīng)用病毒裂解的蛋白）以條帶形式吸附在硝酸纖維素膜條上，當(dāng)條上加入被測(cè)血清標(biāo)本溫育后，如果標(biāo)本中含有特異性抗體時(shí)，則和相應(yīng)抗原帶結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物。通過(guò)洗滌，去掉未結(jié)合的血清，然后加入酶標(biāo)IgG二抗，再溫育，則酶結(jié)合物就結(jié)合到抗原抗體復(fù)合物上，再洗滌，加入底物。,顆粒凝集試驗(yàn)PA,是一種簡(jiǎn)便快速的篩檢試驗(yàn)，其原

5、理為病毒裂解物或重組抗原包被于顆粒載體（紅細(xì)胞，乳膠顆粒，明膠顆粒），使之成為致敏顆粒，再加入血清標(biāo)本，如被測(cè)血清中含有特異性抗體，則因抗體與抗原間橋聯(lián)作用，使致敏顆粒發(fā)生凝集。,病毒檢測(cè)VT,可通過(guò)病毒的分離和培養(yǎng)后進(jìn)行。培養(yǎng)可通過(guò)動(dòng)物培養(yǎng)，雞胚培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行，其中以細(xì)胞培養(yǎng)方法最敏感、經(jīng)濟(jì)和最有前途。病毒感染細(xì)胞后，多數(shù)病毒能引起病變，可直接鏡檢觀察，或通過(guò)血清學(xué)檢查作出鑒定。,病毒的核酸檢測(cè)NAT,病毒核酸分子雜交聚合酶鏈反

6、應(yīng)PCR,乙型肝炎的檢測(cè)技術(shù),1 乙肝病毒的生物學(xué)性狀,形態(tài)與結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)與復(fù)制方式抗原組成動(dòng)物模型與細(xì)胞培養(yǎng)抵抗力,1.1 HBV形態(tài)與結(jié)構(gòu),HBV結(jié)構(gòu)為雙層球形，直徑42nm，具有雙層衣殼。,1.2 HBV基因結(jié)構(gòu)與復(fù)制方式,HBV的DNA基因較小，僅含約3200個(gè)核苷酸，負(fù)股DNA核苷酸序列含有4個(gè)開(kāi)放讀碼框架（OPR）分別稱為S、C、P和X區(qū)。基因及其編碼的抗原：S區(qū)基因

7、 C區(qū)基因 P區(qū)基因 X區(qū)基因 S基因→HBsAg C基因→ HBcAg ↓ ↓前S1 →Pre-S1 前C基因 → HBeAg DNA多聚酶 HBXAg前S2基因→Pre-S2,1.3 HBV抗原的組成,表面抗原HBsAg三種形態(tài) 小球型顆粒、管形顆粒、Da

8、ne顆粒亞型 各亞型均有共同抗原決定簇，稱為a抗原，此外還有2組相互排斥的亞型抗原決定簇（d/y和w/r）。按不同的組合方式構(gòu)成HBsAg四個(gè)基本亞型，即adr,adw,adr,ayw。亞型的分布有明顯的地區(qū)差異和種族相關(guān)性，漢族以adr，少數(shù)民族為ayw，歐美以adw占優(yōu)勢(shì)，ayw主要分布在北非和西非。乙肝ELISA診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)要求adr,adw, ayw三個(gè)亞型的最小檢出量為0.5ng/L。核心抗原HBcAg為內(nèi)衣殼部

9、分，不易在血循環(huán)中檢測(cè)，抗原性強(qiáng)。e抗原HBeAg病毒復(fù)制和具有強(qiáng)感染性的指標(biāo)。,1.4 HBV動(dòng)物模型與細(xì)胞培養(yǎng),黑猩猩是對(duì)HBV最敏感的動(dòng)物。目前采用的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是病毒DNA傳染系統(tǒng)。將病毒DNA導(dǎo)入肝癌等細(xì)胞后，病毒可整合并復(fù)制，在細(xì)胞中表達(dá)HBV抗原。,1.5 HBV抵抗力,HBV 的抵抗力較強(qiáng)，在30℃-32℃可存活6個(gè)月，在-20℃可存活15年，對(duì)低溫、干燥、紫外線均有耐受。不能被70%乙醇滅活，因此不能用這一常

10、規(guī)方法來(lái)消毒。但65℃10 小時(shí) 、煮沸10 分鐘 或高壓蒸氣均可滅活HBV。含氯制劑、環(huán)氧乙烷、戊二醛、0.5%過(guò)氧乙酸和碘伏等也有較好的滅活效果。 消毒可以使HBV失去傳染性，但是HBsAg的抗原性仍可保留。,1.6 HBV markers during early infection,InfectionDay 0HBV DNAVariable, up to 31 days prior to HBsAg by ID

11、NAT( 9-11 days by MP NAT) HBsAgDay 59; disappears Day 120,Infection,120,,InfectionDay 0HBV DNAVariable, up to 31 days prior to HBsAg by ID NAT( 9-11 days by MP NAT) HBsAgDay 59; disappears Day 120,Infectio

12、n,2 乙型肝炎病原體檢測(cè),病毒直接標(biāo)志物病毒抗原：HBsAg、HBeAg、Pre-S1、Pre-S2病毒核酸：HBV DNA間接性標(biāo)志物抗病毒抗體：HBsAb、HBeAb、HBcAb,2.1乙肝抗原抗體的檢測(cè)及結(jié)果分析,HBsAg 陽(yáng)性表示HBV 感染;抗-HBs 為保護(hù)性抗體;HBeAg陽(yáng)性可作為HBV 復(fù)制和傳染性高的指標(biāo);抗-HBe 陽(yáng)性表示HBV 復(fù)制水平低(但有前C 區(qū)突變者例外) ;抗-HBc 總抗體主要是

13、抗-HBc IgG,只要感染過(guò)HBV ,無(wú)論病毒是否被清除,此抗體均為陽(yáng)性;抗-HBc IgM 陽(yáng)性提示HBV 復(fù)制,多見(jiàn)于乙型肝炎急性期。近些年有許多實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了乙肝前S1 抗原檢測(cè),前S1 抗原在病毒感染、裝配、復(fù)制和刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)等方面起著十分重要的作用,被認(rèn)為是比HBeAg 更敏感的病毒復(fù)制標(biāo)志,尤其適合無(wú)條件開(kāi)展HBV DNA 檢測(cè)的醫(yī)療單位。微粒子酶免分析法(MEIA) 及化學(xué)發(fā)光法雖然靈敏度更高, ,但由于價(jià)格昂

14、貴并未能廣泛開(kāi)展。HBV 血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)是從定性檢測(cè)轉(zhuǎn)變?yōu)槎糠治?。HBV 血清學(xué)標(biāo)志傳統(tǒng)上包括HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 和抗-HBc Ig M。,2.2 HBV DNA 及其基因型、變異和cccDNA 的檢測(cè)1,HBV DNA 檢測(cè)HBV DNA 定性和定量檢測(cè)反映了病毒復(fù)制情況或水平,主要用于慢性HBV 感染的診斷、血清HBV DNA 水平的監(jiān)測(cè),以及評(píng)價(jià)抗病毒療效,多使用各

15、種PCR 技術(shù)?；蛐秃妥儺惖臋z測(cè)HBV 病毒可分為8 型,分別為A、B、C、D、E、F、G、H。HBV 基因分型常用的方法有:多重PCR 法;限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法;線性探針?lè)聪螂s交法;全基因序列測(cè)定法等。全基因序列測(cè)序分型的結(jié)果準(zhǔn)確性高,尤其是能發(fā)現(xiàn)兩種不同基因型的重組體感染,被公認(rèn)為HBV 基因分型的金標(biāo)準(zhǔn),但比較昂貴繁瑣,不適合常規(guī)應(yīng)用。目前的研發(fā)趨勢(shì)是針對(duì)有重要臨床意義的HBV 變異進(jìn)行快速、定量的多位點(diǎn)聯(lián)合檢測(cè)。,

16、2.2 HBV DNA 及其基因型、變異和cccDNA 的檢測(cè)2,cccDNA（共價(jià)閉合DNA[covalent closed circular]） 的檢測(cè)　cccDNA 是HBV 的原始復(fù)制模板,對(duì)乙肝病毒的復(fù)制及感染狀態(tài)的建立具有十分重要的意義。Southern blot 是檢測(cè)HBV cccDNA 的經(jīng)典方法,但是該方法過(guò)程比較復(fù)雜,而且靈敏度不高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 不需對(duì)PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行開(kāi)蓋檢測(cè),從而減少了PCR

17、產(chǎn)物污染的可能 ,可對(duì)cccDNA 進(jìn)行定量分析,多被實(shí)驗(yàn)室采用。,2.3 乙肝病毒微生物學(xué)檢查法,HBV感染宿主的免疫學(xué)監(jiān)測(cè)HBV 感染的病程很大程度上取決于宿主的免疫機(jī)能,不同病程時(shí)期的機(jī)體免疫特點(diǎn)、體內(nèi)病毒水平和肝臟損傷程度均不相同,臨床免疫學(xué)檢測(cè)對(duì)HBV 感染的各病程階段的免疫狀態(tài)判斷、指導(dǎo)治療和評(píng)價(jià)療效等方面都有重要的意義。流式細(xì)胞儀可以同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)幾種T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量,監(jiān)控病人的免疫狀態(tài),被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。,3 乙

18、肝診斷試劑的研制進(jìn)展,抗-HBs診斷血清血凝試驗(yàn) 反向被動(dòng)血凝試驗(yàn) RPHA 被動(dòng)血凝試驗(yàn)PHA放射免疫試驗(yàn)RIA酶聯(lián)免疫測(cè)定法（ELISA）試劑DNA聚合酶鏈反應(yīng)PCRHBsAg全血金標(biāo)檢測(cè)試紙條,4 檢測(cè)乙肝時(shí)常見(jiàn)問(wèn)題1,陽(yáng)性漏檢的問(wèn)題一步法試劑的鉤端效應(yīng)，后帶現(xiàn)象。試劑的標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)一步法試劑有3份1：64效價(jià)的HBsAg陽(yáng)性血清，檢測(cè)結(jié)果要求為陽(yáng)性。靈敏度：靈敏度對(duì)于早期檢出有利。窗口期：美國(guó)研究表明90%

19、的HBsAg漏檢是因?yàn)榇翱谄?。?guó)內(nèi)研究表明30%－40%是因?yàn)榇翱谄凇喰蛦?wèn)題ad型檢出率要高于ay型變異HBsAg變異類型有很多，50％－70％變異 株與抗野生株單抗的免疫反應(yīng)減弱或消失。 有部分變異株與野生株在立體構(gòu)型和抗原反應(yīng)性上有明顯的差異 ,因此防治困難。,4 檢測(cè)乙肝時(shí)常見(jiàn)問(wèn)題2,乙肝假陽(yáng)性問(wèn)題類風(fēng)濕因子RF與抗體結(jié)合，造成ELISA和金標(biāo)法的假陽(yáng)性。補(bǔ)體與IgG的Fc段結(jié)合，造成ELISA和金標(biāo)法的假陽(yáng)性。

20、纖維蛋白原與酶結(jié)合物粘附于微板上洗不掉，造成ELISA假陽(yáng)性。稀釋液推進(jìn)劑，金標(biāo)法中應(yīng)先加樣品，后加釋釋劑，否則易出現(xiàn)假陰性。,丙型肝炎的檢測(cè)技術(shù),1 丙肝病毒的生物學(xué)性狀,形態(tài)與結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)與功能丙肝病毒抗體的特點(diǎn)與臨床意義丙肝病毒感染后ALT特點(diǎn)與意義丙肝病毒的生物學(xué)檢測(cè),丙肝病毒簡(jiǎn)介,1974年Golafield首先報(bào)告輸血后非甲非乙型肝炎。1989年Choc等應(yīng)用分子克隆技術(shù)獲得本病毒基因克隆，并命名本病及其病毒為

21、丙型肝炎（HepatitisC）和丙型肝炎病毒（HCV）。由于HCV基因組在結(jié)構(gòu)和表型特征上與人黃病毒和瘟病毒相類似，1991年， 國(guó)際病毒命名委員會(huì)(ICTV)將其歸為黃病毒科丙型肝炎病毒屬。,1.1 形態(tài)與結(jié)構(gòu),HCV病毒體呈球形，直徑小于80nm（在肝細(xì)胞中為36-40nm，在血液中為36-62nm），為單股正鏈RNA病毒，在核衣殼外包繞含脂質(zhì)的囊膜，囊膜上有剌突。HCV體外培養(yǎng)尚未找到敏感有效的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，但黑猩猩對(duì)HCV很

22、敏感。,1.2 HCV基因結(jié)構(gòu)與功能,丙型肝炎病毒是單股正鏈RNA病毒．其基因組含有一個(gè)大約9033個(gè)核苷酸構(gòu)成的大開(kāi)放讀碼框(0RF)，可編碼3010—3033個(gè)氨基酸的多蛋白前體，多蛋白N端的1／4依次為核心蛋白(c)和包膜蛋白(El和E2)等結(jié)構(gòu)蛋白，其余依次為NS2、NS3、NS4和NS 5等非結(jié)構(gòu)蛋白 ，膜蛋白分布于病毒表面，NS3蛋白具有蛋白酶的功能，NS5蛋白為一依賴于RNA的RNA多聚酶．,1.3 HCV抗體的特點(diǎn)與

23、臨床意義,1 抗核心區(qū)抗體抗-C22-3核心區(qū)抗體，核心區(qū)基因保守性強(qiáng)，其抗體出現(xiàn)較早（感染后8-10周），持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，與HCV RNA高度相關(guān)，其血液有較大的傳染性?？?HCe被膜區(qū)抗體，被膜區(qū)基因（E1，E2/NS1）變異程度高，其抗體可用于血清學(xué)分型，用于感染的流行病學(xué)研究。,1.3HCV抗體的特點(diǎn)與臨床意義,2 抗非結(jié)構(gòu)區(qū)抗體抗-C33C 編碼C33C多肽的基因位于NS3中區(qū)，與HCV的復(fù)制有關(guān)，用于HCV感染檢測(cè)，

24、抗-C33C 與抗-C22-3同時(shí)或稍早出現(xiàn)，兩者對(duì)HCV感染具有互補(bǔ)作用，但不能相互替代?？?C100-3 C100-3多肽編碼基因位于NS4區(qū)，從感染后4-32周出現(xiàn)，最長(zhǎng)可達(dá)1年以上，對(duì)感染早期診斷意義不大，在鑒別急性、慢性感染和判斷上有一定價(jià)值。但假陽(yáng)性比例較高，血清中類風(fēng)濕因子，過(guò)氧化物歧化酶、球蛋白、自身抗體等與多肽呈低親和結(jié)合；標(biāo)本放置過(guò)長(zhǎng)或反復(fù)凍融也可出現(xiàn)假陽(yáng)性。抗-NS5 抗-NS5 持續(xù)陽(yáng)性者，ALT多明顯升高

25、，而持續(xù)陰性者，ALT多正?；蜉p度升高，與疾病活動(dòng)相關(guān)。IgM抗體 先于IgG抗體出現(xiàn)，對(duì)感染早期診斷及急、慢性感染具有重要意義。 HCV感染后標(biāo)志物出現(xiàn)的次序：HCV RNA（2周）→ALT （4周）→抗體-NS5 （6周）→抗-C22-3 （7周）→抗-C33C （8周）→抗-C100-3 （9周）,1.4丙肝感染后標(biāo)志物的產(chǎn)生,2 丙肝病毒微生物學(xué)檢查法,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELISA放射免疫測(cè)定法RIA重組免疫印跡實(shí)驗(yàn)（

26、確認(rèn)實(shí)驗(yàn)）血清HCV RNA檢測(cè)雙抗體夾心法測(cè)HCV病毒抗原,2.1丙肝抗體ELISA檢測(cè),第一代抗-HCV試劑盒 采用的抗原C100-3 是HCV非結(jié)構(gòu)基因(NS3／NS4)和人超氧化物歧化酶基因嵌合后表達(dá)的融合蛋白，靈敏度低，漏檢率較高；第二代抗-HCV試劑盒 在第一代基礎(chǔ)上增加了核心區(qū)重組蛋白C22-3和NS3區(qū)重組蛋白-C33C，雖然在靈敏度和特異忡上有很大改善，但仍不能排除由于重組融合蛋白帶來(lái)的少數(shù)假

27、陽(yáng)性和極少數(shù)的漏檢 。第三代抗-HCV試劑盒 其包被抗原為HCV核心抗原、NS3、NS4和NS5抗原，特異性超過(guò)99％，雖然目前缺乏判斷其敏感性的金標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)于免疫功能正常的HCV RNA陽(yáng)性感染者， 抗一HCV檢出率也高于99％。,2.2丙肝病毒核酸RNA的檢測(cè),HCV RNA檢測(cè)包括定性和定量?jī)煞N，定性PCR的靈敏度高于定量PCR，因此定性PCR主要用于急慢性丙型肝炎診斷，而定量PCR則用于療效監(jiān)測(cè)．但該方法在技術(shù)和設(shè)備

28、上要求較高，且費(fèi)時(shí)，檢出率較低，主要原因是：HCV在血液和肝組織中的感染滴度很低，且有一定波動(dòng)：HCV RNA易被血細(xì)胞中的RNA酶降解，因此如果被檢標(biāo)本保存不當(dāng)(例如反復(fù)凍融)將影響檢測(cè)結(jié)果：HCV RNA還受進(jìn)食的影響，易與血中脂質(zhì)及脂蛋白結(jié)合，降低檢出率：另外，RT-PCR的多步驟實(shí)驗(yàn)中任何步驟的問(wèn)題均易影響其檢出．該方法也容易因污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性。為了使HCV RNA的規(guī)范化檢測(cè)：對(duì)患者在空腹條件下抽血，及早分離血清和進(jìn)行檢測(cè)，

29、避免對(duì)標(biāo)本反復(fù)凍融，PCR的整個(gè)過(guò)程應(yīng)避免RNA酶及DNA酶對(duì)標(biāo)本的降解和對(duì)模板的污染。,2.3丙肝病毒核心抗原的檢測(cè),HCV核心抗原的檢出比抗一HCV的檢出約早49 d，用雙抗體夾心法定性或定量檢測(cè)血清樣品中總的或游離的HCV核心抗原，方法簡(jiǎn)單、時(shí)間短、對(duì)環(huán)境要求低以及假陽(yáng)性率低的特點(diǎn)。用途：可用于HCV血清學(xué)轉(zhuǎn)換前的早期急性丙型肝炎診斷、抗一HCV陽(yáng)性感染者的病毒血癥分析以及HCV感染者治療前后病毒血癥追蹤分析等。局限性：由于方

30、法敏感性的限制，HCV RNA水平低于20 000 kTU／L時(shí)不適用。,3檢測(cè)丙肝時(shí)常見(jiàn)問(wèn)題,假陽(yáng)性比較高HCV基因組的變異較大血清中抗-HCV出現(xiàn)較晚不同廠家的試劑對(duì)同一標(biāo)本檢驗(yàn)結(jié)果存在差異,梅毒螺旋體的檢測(cè)技術(shù),1 梅毒螺旋體的生物學(xué)性狀,形態(tài)結(jié)構(gòu)與染色培養(yǎng)特性抵抗力梅毒螺旋體抗體抗TP抗體抗心磷脂抗體，稱反應(yīng)素,基本概念,1.病原性螺旋體（Spirochetes）：是一群細(xì)長(zhǎng)而柔軟、波狀或螺旋狀，運(yùn)動(dòng)活潑的

31、原核細(xì)胞微生物。主要有鉤端螺旋體，梅毒螺旋體，雅司螺旋體和回歸熱螺旋體等。2 .梅毒螺旋體（Treponema pallidum）學(xué)名蒼白密螺旋體，梅毒病原體，對(duì)人有致病性的密螺旋體中最重要的一種。,,1.2 TP形態(tài)結(jié)構(gòu)與染色,TP直徑0.1-0.2微米，長(zhǎng)6-15微米，有8-14年致密而規(guī)則的螺旋，兩端尖直，運(yùn)動(dòng)活潑。電鏡下菌體內(nèi)為軸絲，最外層為外膜，其內(nèi)為胞質(zhì)膜，二者之間為鞭毛樣結(jié)構(gòu)。菌體有蛋白質(zhì)、類脂及糖類，外膜蛋白質(zhì)中P47

32、和軸絲P37抗原具有高度免疫原性，在免疫學(xué)診斷和預(yù)防中可能起重要作用。TP用普通染料不易著色；病灶取材直接檢查，可用不染色新鮮標(biāo)本在暗視野顯微鏡下觀察形態(tài)和運(yùn)動(dòng)方式。,1.3TP培養(yǎng)特性,人工體外培養(yǎng)尚未成功。毒力株螺旋體能在家兔部分組織中繁殖，并保持其對(duì)人及家兔的致病力，但因其分裂繁殖緩慢，30-33小時(shí)才能分裂1次。,1.4TP抵抗力,梅毒螺旋體抵抗力極弱，對(duì)溫度和干燥特別敏感，離體后干燥1-2小時(shí)；血液中4℃放置3天；加熱50

33、 ℃5分鐘即滅活；對(duì)化學(xué)消毒劑亦敏感，對(duì)青霉素、四環(huán)素、紅霉素或砷劑敏感。,1.5梅毒螺旋體抗體,1、抗TP抗體（P15，P17，P47）當(dāng)補(bǔ)體存在時(shí)，可將螺旋體殺死或溶解，也對(duì)吞噬細(xì)胞發(fā)揮調(diào)理作用。在梅毒潛伏期即產(chǎn)生，一期梅毒時(shí)增高，主要是IgM型，二期梅毒時(shí)達(dá)到高峰，有IgG和IgM型，三期梅毒略降低，主要是IgG型，但不是保護(hù)性抗體，晚期梅毒或治療后仍保持陽(yáng)性。2、抗心磷脂抗體，稱反應(yīng)素reagin。同生物組織中的脂質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，

34、反應(yīng)素?zé)o保護(hù)作用，僅可用作梅毒血清學(xué)診斷。一期梅毒時(shí)增高，二期梅毒時(shí)達(dá)到高峰，三期梅毒略降低。,1.6TP抗原,主要為外膜蛋白抗原：p47、p45、p17、p15。 p47具有強(qiáng)免疫原性，是梅毒螺旋體的主要優(yōu)勢(shì)抗原，與另外兩種密螺旋體有交叉反應(yīng)。 p17也具有梅毒螺旋體抗原特異性，與人類正常血成分無(wú)交叉反應(yīng)。,2梅毒螺旋體檢查法,梅毒螺旋體顯微鏡檢查（直接查病原體）主要梅毒血清學(xué)檢查非密螺旋體抗原試驗(yàn)快速反

35、應(yīng)素試驗(yàn)RPR甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)TRUST不加熱血清反應(yīng)素玻片試驗(yàn)USR密螺旋體抗原試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELISA梅毒螺旋體血凝集試驗(yàn)TPHA熒光密螺旋體抗體吸收試驗(yàn)FTA-ABS金標(biāo)快速試紙條法,2.1梅毒螺旋體檢測(cè)方法的評(píng)價(jià),RPR：用于普查，適用于一、二期梅毒反應(yīng)素檢測(cè)，有假陽(yáng)性。FTA-ABS適用于診斷各期梅毒，敏感性和特異性都很高，狼瘡病有假陽(yáng)性反應(yīng)。TPHA：敏感性和FTA-ABS相似，但特異性更高。不

36、用于一期診斷，結(jié)締組織病、麻風(fēng)等可出現(xiàn)假陽(yáng)性。WB：能檢出其四種特異性抗體，作為確認(rèn)試劑有較強(qiáng)的可靠性；ELISA：靈敏度和特異性好；TRUST：同時(shí)存在較高的假陽(yáng)性及假陰性問(wèn)題。,3檢測(cè)梅毒時(shí)常見(jiàn)問(wèn)題,生物學(xué)真陽(yáng)性反應(yīng)密螺旋體屬的螺旋體均具有與梅毒螺旋體完全一樣的類脂質(zhì)抗原，產(chǎn)生的反應(yīng)素的生物學(xué)性狀與梅毒一樣。生物學(xué)假陽(yáng)性反應(yīng)其他非密螺旋體疾病的病原體和其他致病因素所引起的反應(yīng)素反應(yīng)，如：瘧疾、斑疹傷寒、猩紅熱、乙肝、麻風(fēng)

37、、紅斑狼瘡等。人為假陽(yáng)性反應(yīng)采集標(biāo)本過(guò)程中注射器上有類脂質(zhì)，標(biāo)本運(yùn)輸保存不當(dāng)，血液游離出脂肪酸，人血白蛋白增高等；試劑中膽固醇含量增高；檢驗(yàn)人員技術(shù)水平和判斷誤差；反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。,艾滋病的檢測(cè)技術(shù),1 艾滋病毒的生物學(xué)性狀,形態(tài)與結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)與功能病毒復(fù)制培養(yǎng)特性抵抗力HIV感染的免疫應(yīng)答,HIV,HIV基因組包括了逆轉(zhuǎn)錄病毒所共有的3個(gè)基因和6個(gè)調(diào)節(jié)蛋白基因以及5’LTR(long terminal repeat 長(zhǎng)末

38、端重復(fù)序列)3’LTR，它們從左至右分別為： gag，pol，調(diào)節(jié)蛋白，env的順序排列,HIV,gag基因編碼的核心多肽有4個(gè)主要部分：p25和p24、p7、p9、p17，其中p24的特異性最高。,HIV,env基因編碼糖基化的前體gp160。該蛋白后來(lái)分為gp120和gp41。gp120為最外包膜上的糖蛋白，gp41為跨膜蛋白。pol基因編碼病毒復(fù)制所需酶。HIV的免疫診斷使用的抗原決定簇包括：gp41的包膜外側(cè)區(qū)

39、段。另外gp36為HIV II型特異性包被抗原片斷。,HIV Viremia during early infection,11,16,22,Ramp-up viremiaDT = 21.5 hrs,,p24 Ag EIA -,,,,HIV MP-NAT -,HIV ID-NAT -,Peak viremia: 106-108 gEq/mL,“blip” viremia,Viral set-point: 102 -105 gEq/mL

40、,艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢查法,HIV1/2抗體檢測(cè)（包括篩查和確證試驗(yàn)）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELISA快速試紙條明膠顆粒凝集試驗(yàn)PA蛋白印跡實(shí)驗(yàn)WB,艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢查法,病毒載量檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄PCR系統(tǒng)RT-PCR核酸序列依賴性擴(kuò)增技術(shù)NASBA分枝DNA信號(hào)放大系統(tǒng)bDNACD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè),艾滋診斷試劑的研制進(jìn)展,第一代抗-HIV試劑盒第二代抗-HIV試劑盒第三代抗-HIV試劑盒第四代抗-HIV試劑盒,檢測(cè)艾滋時(shí)常見(jiàn)問(wèn)題,