微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本知識(shí)與準(zhǔn)備

1、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本知識(shí)與準(zhǔn)備,適用課程：《藥用微生物》《微生物藥品檢定技術(shù)》,,,實(shí)驗(yàn)一 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本知識(shí)與準(zhǔn)備,一、目的要求熟讀與牢記微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)規(guī)則和安全 ；了解微生物實(shí)驗(yàn)室基本組成；熟知微生物實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。,一、實(shí)驗(yàn)規(guī)則和安全,1．每次實(shí)驗(yàn)前必須對(duì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行充分預(yù)習(xí)，以了解實(shí)驗(yàn)的目的、原理和方法，做到心中有數(shù)，思路清楚。 2．在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中必須穿上實(shí)驗(yàn)服，留長(zhǎng)發(fā)者，必須將長(zhǎng)發(fā)挽在背后。實(shí)驗(yàn)臺(tái)上除了記錄本和筆(

2、記錄筆和記號(hào)筆)以外，不準(zhǔn)堆放任何個(gè)人物品。 3．認(rèn)真及時(shí)做好實(shí)驗(yàn)記錄，對(duì)于當(dāng)時(shí)不能得到結(jié)果而需要連續(xù)觀察的實(shí)驗(yàn)，則需記下每次觀察的現(xiàn)象和結(jié)果，以便分析。,4．實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)保持整潔，勿高聲談話和隨便走動(dòng)，保持室內(nèi)安靜。 5．實(shí)驗(yàn)時(shí)小心仔細(xì)，全部操作應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行，禁止用嘴吸取菌液或試劑，萬一遇有盛菌試管或瓶不慎打破、皮膚破傷等意外情況發(fā)生時(shí)，應(yīng)立即報(bào)告指導(dǎo)教師，及時(shí)處理，切勿隱瞞,6. 實(shí)驗(yàn)過程中，切勿使乙醇(酒精)乙醚、

3、丙酮等易燃藥品接近火焰。如遇火險(xiǎn)，應(yīng)先關(guān)掉火源，再用濕布或沙土掩蓋滅火。必要時(shí)用滅火器。7．使用顯微鏡或其他貴重儀器時(shí)，要求細(xì)心操作，特別愛護(hù)。顯微鏡的目鏡在使用前后必須用浸有乙醇(酒精)的透鏡紙擦凈。對(duì)消耗材料和藥品等要力求節(jié)約，用畢后仍放回原處，嚴(yán)禁將藥匙交叉使用。8．每次實(shí)驗(yàn)完畢后，必須把所用儀器抹凈放妥，將實(shí)驗(yàn)室收拾整齊，擦凈桌面，如有菌液污染桌面或其他地方時(shí)，可用3%來蘇爾液或5%石炭酸液覆蓋半小時(shí)后擦去，如系芽孢桿菌，應(yīng)

4、適當(dāng)延長(zhǎng)消毒時(shí)間。凡帶菌之工具(如吸管、玻璃刮棒等)在洗滌前須浸泡在3%來蘇爾液中進(jìn)行消毒。,9.每次實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行培養(yǎng)的材料，應(yīng)標(biāo)明自己的組別及處理方法，放于教師指定的地點(diǎn)進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室中的菌種和物品等，未經(jīng)教師許可，不得攜出室外。10.每次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，應(yīng)以實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度填入報(bào)告表格中，力求簡(jiǎn)明準(zhǔn)確，認(rèn)真回答思考題，并及時(shí)匯交教師批閱。11.離開實(shí)驗(yàn)室前將手洗凈，注意關(guān)閉門窗、燈、火、煤氣等。,二、微生物實(shí)驗(yàn)室構(gòu)造,微生物實(shí)驗(yàn)室

5、由準(zhǔn)備室、洗滌室、滅菌室、無菌室、恒溫培養(yǎng)室和普通實(shí)驗(yàn)室六部分組成。這些房間的共同特點(diǎn)是地板和墻壁的質(zhì)地光滑堅(jiān)硬，儀器和設(shè)備的陳設(shè)簡(jiǎn)潔，便于打掃衛(wèi)生。,（一）準(zhǔn)備室,準(zhǔn)備室用于配制培養(yǎng)基和樣品處理等。室內(nèi)設(shè)有試劑柜、存放器具或材料的專柜、試驗(yàn)臺(tái)、電爐、冰箱和上下水道、電源等。,（二）洗滌室,洗滌室用于洗刷器皿等。由于使用過的器皿已被微生物污染，有時(shí)還會(huì)存在病原微生物。因此，在條件允許的情況下，最好設(shè)置洗滌室。室內(nèi)應(yīng)備有加熱器、蒸鍋，洗刷

6、器皿用的盆、桶等，還應(yīng)有各種瓶刷、去污粉、肥皂、洗衣粉等。,（三）滅菌室,滅菌室主要用于培養(yǎng)基的滅菌和各種器具的滅菌，室內(nèi)應(yīng)備有高壓蒸汽滅菌器、烘箱等滅菌設(shè)備及設(shè)施。,（四）無菌室,無菌室也稱接種室，是系統(tǒng)接種、純化菌種等無菌操作的專用實(shí)驗(yàn)室。在微生物中，菌種的接種移植是一項(xiàng)主要操作，這項(xiàng)操作的特點(diǎn)就是要保證菌種純種，防止雜菌的污染。在一般環(huán)境的空氣中，由于存在許多塵埃和雜菌，很易造成污染，對(duì)接種工作干擾很大。,4.1 無菌室設(shè)置,無菌

7、室應(yīng)根據(jù)既經(jīng)濟(jì)又科學(xué)的原則來設(shè)置。其基本要求有以下幾點(diǎn)：（1）無菌室應(yīng)有內(nèi)、外兩間，內(nèi)間是無菌室，外間是緩沖室。房間容積不宜過大，以便于空氣滅菌。最小內(nèi)間面積2×2.5＝5 m2，外間面積1×2＝2 m2，高以2.5 m以下為宜，都應(yīng)有天花板。（2）內(nèi)間應(yīng)當(dāng)設(shè)拉門，以減少空氣的波動(dòng)，門應(yīng)設(shè)在離工作臺(tái)最遠(yuǎn)的位置上；外間的門最好也用拉門，要設(shè)在距內(nèi)間最遠(yuǎn)的位置上。,（3）在分隔內(nèi)間與外間的墻壁或“隔扇”上，應(yīng)開一個(gè)小

8、窗，作接種過程中必要的內(nèi)外傳遞物品的通道，以減少人員進(jìn)出內(nèi)間的次數(shù)，降低污染程度。小窗寬60 cm、高40 cm、厚30 cm，內(nèi)外都掛對(duì)拉的窗扇。（4）無菌室容積小而嚴(yán)密，使用一段時(shí)間后，室內(nèi)溫度很高，故應(yīng)設(shè)置通氣窗。通氣窗應(yīng)設(shè)在內(nèi)室進(jìn)門處的頂棚上（即離工作臺(tái)最遠(yuǎn)的位置），最好為雙層結(jié)構(gòu)，外層為百葉窗，內(nèi)層可用抽板式窗扇。通氣窗可在內(nèi)室使用后、滅菌前開啟，以流通空氣。有條件可安裝恒溫恒濕機(jī)。,4.2 無菌室內(nèi)設(shè)備和用具,（1）無菌室

9、內(nèi)的工作臺(tái)，不論是什么材質(zhì)、用途的，都要求表面光滑和臺(tái)面水平。（2）在內(nèi)室和外室各安裝一個(gè)紫外燈（多為30W）。內(nèi)室的紫外線燈應(yīng)安裝在經(jīng)常工作的座位正上方，離地面2 m，外室的紫外線燈可安裝在外室中央。（3）外室應(yīng)有專用的工作服、鞋、帽、口罩、盛有來蘇爾水的瓷盆和毛巾、手持噴霧器和5%石炭酸溶液等。（4）內(nèi)室應(yīng)有酒精燈、常用接種工具、不銹鋼制的刀、剪、鑷子、70%的酒精棉球、工業(yè)酒精、載玻璃片、特種蠟筆、記錄本、鉛筆、標(biāo)簽紙、膠水

10、、廢物筐等。,4.3 無菌室的滅菌消毒,（1）薰蒸：這是無菌室徹底滅菌的措施。無菌室使用了較長(zhǎng)時(shí)間，污染比較嚴(yán)重時(shí)，應(yīng)進(jìn)行薰蒸滅菌?？捎眉兹?、乳酸或硫磺薰蒸。（2）噴霧：在每次使用無菌室前進(jìn)行。噴霧可促使空氣中微粒及微生物沉降，防止桌面、地面上的微塵飛場(chǎng)，并有殺菌作用?？捎?%石炭酸噴霧。（3）紫外線照射：在每次使用無菌室前進(jìn)行。紫外線有較好的殺菌效果。通常應(yīng)開啟紫外線燈照射30～60 min。,4.4 無菌室工作規(guī)程,（1）無菌室

11、滅菌。每次使用前開啟紫外線燈照射30 min以上，或在使用前30 min，對(duì)內(nèi)外室用5%石炭酸噴霧。（2）用肥皂洗手后，把所需器材搬入外室；在外室換上已滅菌的工作服、工作帽和工作鞋，戴好口罩，然后用2%煤酚皂液將手浸洗2分鐘。（3）將各種需用物品搬進(jìn)內(nèi)室清點(diǎn)、就位，用5%石炭酸在工作臺(tái)面上方和操作員站位空間噴霧，返回外室，5～10 min后再進(jìn)內(nèi)室工作。,（4）接種操作前，用70%酒精棉球擦手；進(jìn)行無菌操作時(shí)，動(dòng)作要輕緩，盡量減少空

12、氣波動(dòng)和地面揚(yáng)塵。（5）工作中應(yīng)注意安全。如遇棉塞著火，用手緊握或用濕布包裹熄滅，切勿用嘴吹，以免擴(kuò)大燃燒；如遇有菌培養(yǎng)物灑落或打碎有菌容器時(shí)，浸潤(rùn)5%石炭酸的抹布包裹后，并用浸潤(rùn)5%石炭酸的抹布擦拭臺(tái)面或地面，用酒精棉球擦手后再繼續(xù)操作。（6）工作結(jié)束，立即將臺(tái)面收拾干凈，將不應(yīng)在無菌室存放的物品和廢棄物全部拿出無菌室后，對(duì)無菌室用5%石炭酸噴霧，或開紫外線燈照射30 min。,（五）恒溫培養(yǎng)室,1. 培養(yǎng)室的設(shè)置（1）培養(yǎng)室應(yīng)

13、有內(nèi)、外兩間，內(nèi)室是培養(yǎng)室，外室是緩沖室。房間容積不宜大，以利于空氣滅菌，內(nèi)室面積在3.2×4.4＝14 m2左右，外室面積在3.2×1.8＝6 m2左右，高以2.5 m左右為宜，都應(yīng)有天花板。（2）分隔內(nèi)室與外室的墻壁上部應(yīng)設(shè)帶空氣過濾裝置的通風(fēng)口。（3）為滿足微生物對(duì)溫度的需要，需安裝恒溫恒濕機(jī)。（4）內(nèi)外室都應(yīng)在室中央安裝紫外線燈，以供滅菌用。,2. 培養(yǎng)室內(nèi)設(shè)備及用具（1）內(nèi)室通常配備培養(yǎng)架和搖瓶機(jī)（

14、搖床）。常用的搖瓶機(jī)有旋轉(zhuǎn)式、往復(fù)式兩種。（2）外室應(yīng)有專用的工作服、鞋、帽、口罩、手持噴霧器和5%石炭酸溶液、70%酒精棉球等。3. 培養(yǎng)室的滅菌、消毒同無菌室的滅菌、消毒措施。小規(guī)模的培養(yǎng)可不啟用恒溫培養(yǎng)室，而在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行。,（六）普通實(shí)驗(yàn)室,進(jìn)行微生物的觀察、計(jì)數(shù)和生理生化測(cè)定工作的場(chǎng)所。室內(nèi)的陳設(shè)因工作側(cè)重點(diǎn)不同而有很大的差異。一般均配備實(shí)驗(yàn)臺(tái)、顯微鏡、柜子及凳子。實(shí)驗(yàn)臺(tái)要求平整、光滑，實(shí)驗(yàn)柜要足以容納日常使用的用

15、具及藥品等。,（一）凈化工作臺(tái)(Clean Bench) 凈化工作臺(tái)是一種局部層流裝置，能在局部形成高潔度的工作環(huán)境。它由工作臺(tái)、過濾器、風(fēng)機(jī)、靜壓箱和支撐體等組成，采用過濾空氣使工作臺(tái)操作區(qū)達(dá)到凈化除菌的目的。室內(nèi)空氣經(jīng)預(yù)過濾器和高效過濾除塵后以垂直或水平層流狀態(tài)通過工作臺(tái)的操作區(qū)，由于空氣沒有渦流，所以，任何一點(diǎn)灰塵或附著在灰塵上的雜菌都能被排除，不易向別處擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。因此，可使操作區(qū)保持無菌狀態(tài)。,三、微生物

16、實(shí)驗(yàn)室的主要設(shè)備,（二）高壓蒸汽滅菌鍋高壓蒸汽滅菌鍋是一個(gè)密閉的、可以耐受一定壓力的雙層金屬鍋。鍋底或夾層內(nèi)盛水，當(dāng)水在鍋內(nèi)沸騰時(shí)由于蒸汽不能逸出，使鍋內(nèi)壓力逐漸升高，水的沸點(diǎn)和溫度可隨之升高，從而達(dá)到高溫滅菌的目的。一般在0.11MPa的壓力下，121℃滅菌20~30 min，包括芽孢在內(nèi)的所有微生物均可被殺死。如果滅菌物品體積較大，蒸汽穿透困難，可以適當(dāng)提高蒸汽壓力或延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。高壓滅菌鍋有臥式、立式、手提式等多種類型，在微生物

17、學(xué)實(shí)驗(yàn)室，最為常用的是手提式和立式高壓蒸汽滅菌鍋。,（三）培養(yǎng)箱（Culture Box）培養(yǎng)箱是培養(yǎng)微生物的專用設(shè)備。制熱式培養(yǎng)箱是由電爐絲和溫度控制儀合成的固定體積的恒溫培養(yǎng)裝置，大小規(guī)格不一。微生物實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)箱工作容積有450×450×350 mm3或650×500×500 mm3適用于室溫至60℃之間的各類微生物培養(yǎng)。有各種結(jié)構(gòu)合理、功能齊全的培養(yǎng)箱，如恒溫培養(yǎng)箱、恒溫恒

18、濕培養(yǎng)箱、低溫培養(yǎng)箱、微生物多用培養(yǎng)箱和二氧化碳培養(yǎng)箱等。,搖床（Shaking Bed） 搖床又稱搖瓶機(jī)，它是培養(yǎng)好氣性微生物的小型試驗(yàn)設(shè)備或作為種子擴(kuò)大培養(yǎng)之用，常用的搖床有往復(fù)式和旋轉(zhuǎn)式兩種。往復(fù)式搖床的往復(fù)頻率一般在80~140次/min，沖程一般為5~14cm，如頻率過快、沖程過大或瓶?jī)?nèi)液體裝量過多，在搖動(dòng)時(shí)液體會(huì)濺到包扎瓶口的紗布或棉塞上，導(dǎo)致雜菌污染，特別是啟動(dòng)時(shí)更容易發(fā)生這種情況。旋轉(zhuǎn)式搖床的偏心