第四節(jié) 基因定位常用的方法

1、1,第四節(jié) 基因定位常用的方法,Wilson于1911年將紅綠色盲基因首次定位于X染色體上,開創(chuàng)了人類基因定位的先河.1968年,Donahue利用系譜分析的方法將Duffy血型基因定位于1 號(hào)染色體上,是人類首次在常染色體上進(jìn)行的基因定位.20世紀(jì)70年代后,體細(xì)胞雜交重組DNA、分子雜交和PCR等技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用，基因定位的方法愈加先進(jìn)，基因定位的速度、數(shù)量明顯加快。人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和完成，更加促進(jìn)了基因定位的進(jìn)程。

2、基因定位對(duì)提高人類對(duì)疾病產(chǎn)生的病因?qū)W的認(rèn)識(shí)有重要意義。,2,明確幾個(gè)基本概念,基 因：DNA的功能片段?；蚪M：有機(jī)體全部DNA序列（它包括基因 外的非基因DNA序列），它是基因和 非基因DNA序列的總和?；蚨ㄎ唬菏怯靡欢ǖ姆椒▽⒒虼_定到染 色體的實(shí)際位置。,3,遺傳做圖：是以研究家族的減數(shù)分裂，以了解兩個(gè)基因分離趨勢(shì)為基礎(chǔ)來(lái)繪制基因座位間的距離，它表明基因之間連鎖關(guān)系和相對(duì)距

3、離，并以重組率來(lái)計(jì)算和表示，以厘摩（cM）為單位。染色體定位：只把基因定位到某條染色體上。 細(xì)胞水平上的基因圖又稱細(xì)胞遺傳圖區(qū)域定位：從細(xì)胞遺傳學(xué)水平，用染色體顯帶等技術(shù)在光學(xué)顯微鏡下觀察，將基因定位到染色體的具體區(qū)帶。,4,一、基因定位的方法,1、體細(xì)胞雜交法基因定位：體細(xì)胞：即生物體除生殖細(xì)胞外的任一細(xì) 胞。1）體細(xì)胞雜交的概念： 也稱細(xì)胞融合（cell infusion），是將來(lái)源不

4、同的兩種細(xì)胞融合成一個(gè)新細(xì)胞。新產(chǎn)生的細(xì)胞稱雜種細(xì)胞（hybrid cell），含雙親不同的染色體。,5,2）對(duì)象： 人的細(xì)胞 鼠類：大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠 3）雜種細(xì)胞的特點(diǎn)： 在繁殖傳代過(guò)程中，人的染色體優(yōu)先丟失，以至最后只剩幾條或一條人的染色體，而嚙齒類的染色體被保留下來(lái)。,,6,4）原理： 細(xì)胞進(jìn)行融合時(shí)，培養(yǎng)液中只有部分細(xì)胞融合成雜種細(xì)胞，還有大量未融合的雙親細(xì)胞。這就需要選擇分離純化

5、雜種細(xì)胞。為此要?jiǎng)?chuàng)造一種只讓雜種細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而親本細(xì)胞死亡的環(huán)境。這就要利用雜種細(xì)胞和親本細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)條件的要求和代謝的差異來(lái)進(jìn)行選擇。其中最常用的是HAT選擇系統(tǒng)。,7,HAT選擇系統(tǒng)：,人的突變細(xì)胞株：缺乏HGPRT酶 小鼠細(xì)胞株：缺乏TK酶 兩者融合培養(yǎng)于HAT培養(yǎng)基中 HAT培養(yǎng)基： H為次黃嘌呤，是HGPRT的底物，為DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料） A可阻斷正常的DNA

6、合成（嘌呤及TMP合成受抑制） T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，為DNA合成提供原料,8,因此在HAT培養(yǎng)基上,人細(xì)胞： ①由于A的存在，正常的DNA 合成通路受阻 。 ②同時(shí)由于HGPRT的缺乏，無(wú)法利用次黃嘌呤通過(guò)旁路合成DNA（ 嘌呤合成障礙）,9,鼠細(xì)胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT可以利用次黃嘌呤合成腺嘌呤，鳥嘌呤，但由于無(wú)TK，無(wú)法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障礙 ）

7、 雜種細(xì)胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鳥嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成）,10,將篩選出來(lái)的雜種細(xì)胞轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫學(xué)特性，Miller等運(yùn)用體細(xì)胞雜交并結(jié)合雜種細(xì)胞的特征，證明雜種細(xì)胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含有人17號(hào)染色體的雜種細(xì)胞都因有TK活性而存活，反之則死亡，從而推斷TK基因定位于17號(hào)染色體上，這是首例應(yīng)用體細(xì)胞雜交法進(jìn)行的基因定位。,11

8、,,,鼠,人,,X,,,TK-HPRT+,TK+HPRT-,,,,,,鼠,人,,,鼠,人,,,,鼠,人,,TK+HPRT+,,,,,,,,,,,,,17 3,17,3,17 3,TK+,TK+,TK-,HAT,,,,,,,12,②克隆嵌板法(clone panel method) 根據(jù)不同雜種細(xì)胞保留或丟失的人染色體有時(shí)是重疊的情況,設(shè)計(jì)的一種簡(jiǎn)便而實(shí)用的基因定位方法。

9、 克隆嵌板 雜種克隆 保留的人染色體 1 2 3 4 5 6 7 8 A + + + + - - - - B + + -

10、 - + + - - C + - + - + - + -,,,,13,2.原位雜交和熒光原位雜交,1）原位雜交（in situ hybridization）：是最直接的基因定位方法之一，是分子生物學(xué)技術(shù)在基因定位中的應(yīng)用，胰島素基因用此方法定位于11p15。 2）原理：堿基的互補(bǔ)配對(duì)，同源的DNA-DNA雙鏈或DN

11、A-RNA雙鏈在一定條件下能結(jié)合成雙鏈。用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA、RNA或與mRNA互補(bǔ)的cDNA作探針，可檢測(cè)細(xì)胞基因組中的同源部分。,14,,3）原位雜交的特點(diǎn)： 雜交在載玻片上的中期染色體上進(jìn)行，而不是在溶液和膜上進(jìn)行。所謂原位是指在標(biāo)本上DNA原位變性，再與放射性或非放射性物質(zhì)（通常用3H）標(biāo)記的已知核酸探針雜交，通過(guò)放射自顯影來(lái)檢測(cè)染色體上特異DNA或RNA順序，用放射性顆粒在某條染色體的區(qū)帶出現(xiàn)的最高頻率或

12、熒光的強(qiáng)度來(lái)確定探針的位置，從而準(zhǔn)確地進(jìn)行基因定位。,15,4）原位雜交的步驟,制備中期染色體 DNA原位變性 變性 放射性或非放射性標(biāo)記探針 雜交（在載玻片上） 洗膜 放射性標(biāo)記：放射自顯影

13、 檢測(cè) 非放射性標(biāo)記：熒光染料與抗體或蛋白結(jié)合 記錄雜交信號(hào) 結(jié)合染色體形態(tài)進(jìn)行基因定位,,,,,,,,,16,5）熒光原位雜交（florescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）,用特殊熒光素（dig或Biotin）標(biāo)記探針DNA（Nick translation 標(biāo)記法），變性成單鏈后與變性后的染色體或細(xì)

14、胞核靶DNA雜交。在熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。FISH優(yōu)點(diǎn)：可用來(lái)作基因或特定DNA片段的染色體區(qū) 域定位。缺點(diǎn)：必須在已知探針的情況下方可進(jìn)行。,17,單色FISH,18,多色FISH,19,3.連鎖分析（Linkage analysis）,1）概念： 基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點(diǎn)進(jìn)行定位

15、。,20,2）重組值（recombination fraction） 是基因定位時(shí)兩個(gè)基因間遺傳圖距的量度，即基因間的遺傳距離。如果兩個(gè)基因間有1%的重組值，其遺傳圖的距離為1厘摩。（centimorgan，cM）3）遺傳標(biāo)記（genetic marker） 用連鎖分析發(fā)法進(jìn)行基因定位需要已知的記憶內(nèi)作為遺傳標(biāo)記，這些標(biāo)記按孟德爾方式遺傳，標(biāo)記位點(diǎn)應(yīng)是多態(tài)的。,21,22,致病基因和標(biāo)記座的連鎖,23,遺傳多態(tài)性：

16、是指在一個(gè)遺傳座位上具有一個(gè)以上的等位基因，且各個(gè)等位基因在群體中出現(xiàn)的頻率皆高于1%。常用的遺傳標(biāo)記： ①ABO血型蛋白多態(tài) ②血清蛋白泳動(dòng)學(xué)改變 ③HLA ④RFLP 小衛(wèi)星DNA：VNTR 6-12個(gè)核苷酸DNA多態(tài) ⑤VNTR 微衛(wèi)星DNA：STR2-6個(gè)的

17、VNTR ⑥ SNPs,,,,,24,二、基因克隆 致病基因克隆有兩種基本策略 功能克隆 定位克隆 1、功能克隆(functional cloning) 是利用疾病已知的遺傳損傷而引起的生化功能如蛋白質(zhì)氨基酸缺陷的信息,進(jìn)行基因定位,進(jìn)而克隆該基因.,,25,2、定位克隆(positional cloning) 是先進(jìn)行基因定位作圖,然后找

18、到來(lái)自該定位區(qū)的基因并進(jìn)行克隆,在此之后才能明確該基因的功能. 功能克隆和定位克隆的比較: 在傳統(tǒng)的功能克隆中,基因功能的研究先于基因鑒定.在定位克隆中,基因定位在先,最后再鑒定基因.基因已鑒定后,可以進(jìn)行基因功能的選擇性研究.,26,27,定位克隆鑒定的第一批基因利用了特定基因座的染色體畸變，Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)基因的克隆是一個(gè)重要的例子。,28,假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD/BMD),由于抗肌萎

19、縮蛋白(dystrophin)遺傳性缺陷所致的進(jìn)行性肌萎縮的致死性神經(jīng)肌肉性遺傳病,發(fā)病率為1/3500，XR遺傳。 主要癥狀:通常3---5歲發(fā)病,開始走路不穩(wěn),鴨型步態(tài),上樓梯困難,Gower征陽(yáng)性.進(jìn)行性肌萎縮伴有腓腸肌假性肥大,10多歲下肢癱,一般在20多歲之前死于心衰或呼吸衰竭.,29,DMD基因克隆的方法,研究者們通過(guò)對(duì)幾個(gè)女性患者的細(xì)胞遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)每個(gè)病例受累的常染色體不同但在X染色體上的斷裂點(diǎn)總是p21。 同時(shí)

20、一個(gè)無(wú)任何遺傳缺陷家族史的男孩被發(fā)現(xiàn)患有DMD等4種X連鎖隱性遺傳病，在這個(gè)獨(dú)一無(wú)二個(gè)體的引發(fā)下，經(jīng)過(guò)仔細(xì)的遺傳學(xué)研究，最終發(fā)現(xiàn)了Xp21.1的微小缺失。,30,DMD女性患者的核型,31,X染色體與常染色體易位時(shí)X染色體失活的結(jié)果,32,兩個(gè)研究小組分別采用兩種不同的方法克隆了DMD基因： 一組是通過(guò)X常染色體易位，克隆了該基因的一部分。 另一研究組使用有Xp21.1微小缺失的男孩的DNA，利用消減技術(shù)，獲得了在正