葡萄糖耐量的試驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握測(cè)定血清葡萄糖濃度的原理掌握血糖變化的臨床生理意義掌握口服葡萄糖耐量試驗(yàn)的原理，適用人群和臨床意義。,,臨床上OGTT主要適用于下列情況：（1）無(wú)糖尿病癥狀，空腹血糖異常，或偶爾出現(xiàn)糖尿，或有明顯糖尿病家族史者；（2）有糖尿病癥狀，血糖水平不夠糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)者；（3）妊娠期或甲狀腺功能亢進(jìn)出現(xiàn)糖尿者；（4）不明原因腎病與視網(wǎng)膜病者。,實(shí)驗(yàn)原理,葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）是一種葡萄糖負(fù)荷試驗(yàn)，用于檢查人體胰島素B細(xì)胞功能

2、和機(jī)體對(duì)糖的調(diào)節(jié)能力。正常人進(jìn)食后血糖都會(huì)暫時(shí)性升高，30~60分鐘后可升到最高峰，但一般不超過(guò)8.9mmol/L，2小時(shí)左右又會(huì)回到空腹水平。這種現(xiàn)象稱(chēng)為耐糖現(xiàn)象。若內(nèi)分泌失調(diào)或神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，則調(diào)節(jié)功能失常，食入大量糖后血糖濃度可急劇上升，短時(shí)間不能恢復(fù)到原值，稱(chēng)為耐糖失?，F(xiàn)象。所以觀察耐糖現(xiàn)象可以了解調(diào)節(jié)血糖的各種機(jī)能是否健全。,,血清葡萄糖濃度測(cè)定方法1、GOD-POD法：以過(guò)氧化物酶作指示酶的偶聯(lián)酶反應(yīng)定量法。葡萄糖氧化

3、酶（GOD）利用氧將葡萄糖氧化為葡萄糖酸，同時(shí)釋放過(guò)氧化氫。過(guò)氧化物酶（POD）催化過(guò)氧化氫氧化色素原（如4-氨基安替比林和苯酚），并使色素原氧化成色素，即Trinder反應(yīng)。紅色醌類(lèi)化合物的生成量與葡萄糖含量成正比。,反應(yīng)方程式：,GOD 葡萄糖+O2+H2O———— 葡萄糖酸+2H2O2 POD2H2O2+4-氨基安替比林+苯酚————紅色

4、醌類(lèi)化合物,,葡萄糖氧化酶法是利用葡萄糖氧化酶氧化β葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖酸和雙氧水的反應(yīng)而建立。血糖的酶法測(cè)定是利用酶的特異性催化而建立起來(lái)的，具有高度的特異性，同時(shí)，可以避免使用化學(xué)方法中的一些有害試劑等。操作過(guò)程簡(jiǎn)便，便于自動(dòng)化檢測(cè),,2、鄰甲苯胺法：葡萄糖為一含醛基的己糖，在酸性條件下加熱，可脫水生成5-羥甲基-2-呋喃甲醛，后者與鄰甲苯胺縮合成青色的Suchiff堿。 Suchiff堿顏色的深淺與樣品中葡萄糖的含量成正比與進(jìn)行同

5、樣處理的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液相比較，即可求出樣品中葡萄糖的含量。由于鄰甲苯胺只與醛糖作用顯色，故此種測(cè)定方法不受血液中其他還原物質(zhì)的干擾，測(cè)定時(shí)也無(wú)需除去血漿或血清中的蛋白質(zhì)。,反應(yīng)方程式：,[H+]葡萄糖——5-羥甲基-2-呋喃甲醛+3H2O 加熱5-羥甲基-2-呋喃甲醛+鄰甲苯胺——Schiff堿+H2O

6、 青色,3、其他方法舉例 福林—馬爾露斯（Folin-Malmors）超微量法：在熱堿溶液中的葡萄糖可將高鐵氰化鉀還原為低鐵氰化鉀，后者再與硫酸高鐵鹽作用生成亞鐵氰化鐵（普魯士藍(lán)），與同樣處理的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行比色，即可求出血糖含量。 其反應(yīng)如下：,血糖測(cè)定方法歸納,血糖的測(cè)定方法按測(cè)定原理可分為無(wú)機(jī)化學(xué)方法、有機(jī)化學(xué)方法和生物化學(xué)方法三類(lèi)。此外，還有固相酶法、電化學(xué)法及質(zhì)譜法等。常用的是分光光度法和酶學(xué)方法。分光光度

7、法中常見(jiàn)的是鄰甲苯胺法，是利用葡萄糖在加熱的有機(jī)酸溶液中與某些芳香族胺類(lèi)，可生成有色衍生物這一原理建立的。酶學(xué)方法有葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法和葡萄糖脫氫酶法等。(己糖激酶法)原理是用已糖激酶催化葡萄糖同ATP反應(yīng)，產(chǎn)生葡萄糖－6－磷酸及ADP，葡萄糖－6－磷酸在葡萄糖－6－磷酸脫氧酶存在時(shí)，同NADP＋作用．產(chǎn)生NADPH及6—磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯，NADPH在340nm有吸收峰。,應(yīng)用鄰甲苯胺法測(cè)定血糖濃度來(lái)檢測(cè)葡萄糖耐量,,實(shí)驗(yàn)試劑：

8、,1．鄰甲苯胺試劑   鄰甲苯胺為略帶黃色的油狀液體，易氧化，配置時(shí)易重蒸餾，收集199—201℃時(shí)無(wú)色或淺黃色的餾出液。取硫脲2.5g，溶解于750mL冰醋酸中，再將此溶液移入1000mL容量瓶，加鄰甲苯胺150mL、2.4%硼酸100mL，然后加冰醋酸至刻度。2．12mmol/L苯甲酸溶液 稱(chēng)取苯甲酸2.5g，加入蒸餾水1000ml,加熱助溶，冷卻后儲(chǔ)存于試劑瓶中。 3.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯存液（10mg/

9、mL）  準(zhǔn)確稱(chēng)取無(wú)水葡萄糖1.0000g,用飽和苯甲酸溶液溶解，移至100ml容量瓶中，稀釋至刻度。 4．葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（1mg/mL） 用飽和苯甲酸溶液將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液溶液稀釋10倍。,實(shí)驗(yàn)步驟：,受試者前三天正常飲食，停用影響血糖的各種藥物，如胰島素、腎上腺皮質(zhì)素、兒茶酚胺等。試驗(yàn)前1天晚餐后即不再進(jìn)食（即空腹10~14小時(shí)）。次日清晨空腹抽靜脈血2ml（稱(chēng)為空腹血漿血糖，即FPG），然后將75g葡萄糖

10、溶于200 ~300ml溫開(kāi)水中（兒童按每千克體重1. 75g），令受試者5min內(nèi)服 下。服后0.5小時(shí)、1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)各抽一次血，取七支試管按下表操作：,測(cè)定血清中血糖濃度方法：取三支試管，按表操作,混勻，置沸水浴中煮沸15分鐘，取出冷卻后用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)630nm處，以空白調(diào)零，讀取標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管的吸光度。,計(jì)算公式：,,應(yīng)用GOD-POD法測(cè)定血糖濃度來(lái)檢測(cè)葡萄糖耐量,實(shí)驗(yàn)器材與試劑：,器材：5ml移液管5

11、0或100ul微量可調(diào)式移液器721E分光光度計(jì)1cm比色皿37℃恒溫水浴,,試劑：1、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0） 稱(chēng)取無(wú)水磷酸氫二鈉8.67g及無(wú)水磷酸二氫鉀5.3g溶于蒸餾水800ml中，調(diào)pH7.0，定容至1L。2、酶試劑 取過(guò)氧化物酶12000U，葡萄糖氧化酶1200U，4-氨基安替比林10mg，置4℃保存，可穩(wěn)定存放3個(gè)月。3、酚溶液 稱(chēng)取重蒸餾酚100mg溶于

12、蒸餾水100ml中，用棕色瓶貯存。4、酶酚混合試劑 將酶試劑及酚溶液等量混合，4℃可以存放1個(gè)月。,,5、12mmol/L苯甲酸溶液 取苯甲酸1.4g，于800ml蒸餾水中加溫助溶，冷卻后加蒸餾水定容至1L。6、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯存液（100mmol/L） 稱(chēng)取已干燥恒重的無(wú)水葡萄糖1.802g，溶于約70ml 12mmol/L苯甲酸溶液中，以12mmol/L苯甲酸溶液定容至100ml。2h后方可使用

13、。（防止氧化的作用 ，葡萄糖為單糖，含醛基，易氧化成羧基，加入苯甲酸，平衡向左移動(dòng) ）7、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液（5mmol/L） 吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯存液5.00ml放于100ml容量瓶中，用12mmol/L苯甲酸溶液稀釋至刻度，混勻。,實(shí)驗(yàn)步驟：,受試者前三天正常飲食，停用影響血糖的各種藥物，如胰島素、腎上腺皮質(zhì)素、兒茶酚胺等。試驗(yàn)前1天晚餐后即不再進(jìn)食（即空腹10~14小時(shí)）。次日清晨空腹抽靜脈血2ml（稱(chēng)為空腹血漿血糖，即FPG

14、），然后將75g葡萄糖溶于200 ~300ml溫開(kāi)水中（兒童按每千克體重1. 75g），令受試者5min內(nèi)服 下。服后0.5小時(shí)、1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)各抽一次血，取七支試管按下表操作：,,,混勻，置37℃水浴中，保溫15min，在波長(zhǎng)510nm處比色，以空白管調(diào)零，讀取標(biāo)準(zhǔn)管及測(cè)定管吸光度。然后分別計(jì)算出葡萄糖濃度C0、C1、C2、C3、C4。計(jì)算公式: 血清葡萄糖（mmol/L）=（A測(cè)定/A標(biāo)準(zhǔn)）*5將各次血

15、糖測(cè)定結(jié)果，與相應(yīng)的時(shí)間繪制成糖耐量曲線圖，以便進(jìn)行分析。,注意事項(xiàng)：,實(shí)驗(yàn)前受試者應(yīng)充分休息，避免體力活動(dòng)，試驗(yàn)中亦不能吸煙、喝咖啡，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。葡萄糖氧化酶對(duì)β-D葡萄糖高度特異，溶液中葡萄糖約36%為α型，64%為β型。葡萄糖的完全氧化需要α型到β型的變旋反應(yīng)。新配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液主要是α型，故需放置2h以上（最好過(guò)夜），待變旋平衡后方可應(yīng)用。,,葡萄糖氧化酶法可以直接測(cè)定腦脊液葡萄糖含量，但不能直接測(cè)定尿液葡萄糖含量。因

16、為尿液中尿酸等干擾性物質(zhì)濃度過(guò)高，可干擾過(guò)氧化物酶反應(yīng)，造成結(jié)果假性偏低。因紅細(xì)胞的酵解將導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低，建議測(cè)定樣品以草酸鉀-氟化鈉做抗凝劑以抑制糖酵解。嚴(yán)重黃疸、溶血及乳糜樣血清應(yīng)先制備無(wú)蛋白血濾液，然后再進(jìn)行測(cè)定。,臨床意義：,生理性高血糖可見(jiàn)攝入高糖食物后，或情緒緊張腎上腺素分泌增加時(shí)。病理性高血糖 （1）糖尿?。翰±硇愿哐浅Ｒ?jiàn)于胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足的糖尿病患者。 （2）內(nèi)分泌腺功能障礙：甲狀腺功能亢進(jìn)、腎上腺

17、皮質(zhì)功能及髓質(zhì)功能亢進(jìn)，引起的各種對(duì)抗胰島素的激素分泌過(guò)多，或升高血糖的激素增多引起的高血糖，現(xiàn)已歸入特異性糖尿病中。,,（3）顱內(nèi)壓增高：顱內(nèi)壓增高刺激血糖中樞，如顱外傷、顱內(nèi)出血、腦膜炎等，引起血糖增高。（4）脫水引起的高血糖：如嘔吐、腹瀉和高熱等也可使血糖輕度增高。生理性低血糖：見(jiàn)于饑餓和劇烈運(yùn)動(dòng)。病理性低血糖：特發(fā)性功能性低血糖最多見(jiàn)，依次是藥源性、肝源性和胰島素瘤等。,臨床判斷：,正常耐糖量：空腹血糖<6.1mm

18、ol/L，口服1小時(shí)內(nèi)血糖值升高至最高峰，但不超過(guò)11.1mmol/L，2小時(shí)后血糖水平（2hPG）基本恢復(fù)空腹水平，即2hPG<7.8mmol/L。各次尿液中均未檢出糖?？崭寡菗p害（IFG）：6.1mmol/L≤FPG＜7.0mmol/L，2小時(shí)后血糖水平＜7.8mmol/L。糖耐量減退（IGT）:FPG＜7.0mmol/L以及7.8mmol/L≤2hPG＜11.1mmol/L。,,糖尿?。篎PG≥7.0mmol/L,2h

19、PG≥11.1mmol/L。耐量增加 見(jiàn)于腎上腺皮質(zhì)功能減退患者，垂體前葉功能減退、甲狀腺功能減退及胰島素分泌過(guò)多。其曲線特征是：（1）空腹血糖值低于正常值；（2）服糖后不出現(xiàn)血糖高峰；（3）1小時(shí)內(nèi)血糖即可恢復(fù)原值。,,腎性糖尿，耐糖量曲線屬正常，服糖后出現(xiàn)糖尿，此現(xiàn)象稱(chēng)為腎性糖尿。 16 14mmol/L 12糖耐量正常 10糖耐量減退

20、 8空腹血糖損害 6糖尿病性他糖量 4 2 0 30 60 90 120 測(cè)定時(shí)間（min）,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,目前國(guó)內(nèi)醫(yī)院多采用葡萄糖氧化酶法和鄰甲苯胺法測(cè)定血糖。前