滅菌工藝基礎知識資料

1、滅菌工藝基礎知識,滅菌和消毒的目的與定義,消毒、滅菌的目的：抗生素發(fā)酵是純種培養(yǎng)過程，培養(yǎng)基在儲存、運輸、加工、配制過程中不同程度污染了多種雜菌，需要通過嚴格的消毒、滅菌以徹底清除雜菌。消毒的定義：消毒是指應用消毒劑等方法殺滅物體表面和內(nèi)部的病原菌營養(yǎng)體， 但不一定能殺死細菌芽孢的方法滅菌的定義：用物理或化學方法殺滅或除掉物料及設備中所有的生命物質(zhì)的工藝過程。包括致病和非致病微生物以及芽孢。 滅菌比較徹底。消毒、滅菌的重要性：消毒

2、、滅菌工作在發(fā)酵車間占有舉足輕重的地位。,滅菌的方法,1、化學滅菌法：使用化學藥劑如甲醛、苯酚、新潔爾滅、過氧乙酸、高錳酸鉀、漂白粉等進行某些容器或物料及無菌區(qū)域的滅菌。2、物理滅菌：主要有射線滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌和過濾除菌。3、按溫度劃分：100℃為常用消毒殺菌溫度，100-120℃為高溫滅菌，120-150℃為超高溫滅菌。4、濕熱滅菌比干熱滅菌更有效，對芽胞的殺滅效果更佳。,濕熱滅菌法,濕熱滅菌法的原理,通過飽和蒸汽加熱、

3、加壓，使溫度上升到微生物致死范圍，菌體蛋白質(zhì)或核酸發(fā)生變性、凝固、繼而死亡。,消毒介質(zhì)----飽和蒸汽,抗生素培養(yǎng)基通常以飽和蒸汽做為滅菌介質(zhì)。 飽和蒸汽滅菌（濕熱滅菌）的優(yōu)點(題解1）： 1）本身無毒、無公害。 2）蒸汽具有很大潛熱，穿透力強，有利于徹底滅菌。 3）制備輸送容易，調(diào)節(jié)方便，操作上易管理。,決定滅菌效果的主要因素,滅菌效果取決于——菌的種類與滅菌溫度。 微生物有一個共同的行為特征——耐熱性。

4、不同的微生物耐熱性（滅菌溫度）不同；相同溫度下，芽胞比生長期細菌的耐熱性強。滅菌效果僅與菌的種類與滅菌溫度有關。,細菌芽胞滅菌時間和溫度,灰黃霉素的菌體形態(tài)（發(fā)酵液）,決定滅菌效果的主要因素,由上表可以看出，芽胞比生長期細菌的耐熱性強。芽胞：是細菌抵抗外界不良環(huán)境（高溫、低溫、光線、干燥、化學品）的休眠體，具有很強的耐熱性。因此，以殺滅最耐熱的芽胞為標準，把121℃、30分鐘作為最安全的滅菌溫度和滅菌時間。,滅菌對培養(yǎng)基的影響,濕熱

5、滅菌屬于高溫滅菌，滅菌的時間越長、溫度越高，營養(yǎng)成分破壞也越嚴重。滅菌是一把雙刃劍，在保證全部殺滅雜菌的同時為抗生素純種發(fā)酵提供無菌培養(yǎng)基，還不同程度地破壞培養(yǎng)基，同時發(fā)生一系列物理、化學反應。各車間根據(jù)培養(yǎng)基特點、工藝要求，在經(jīng)過理論計算、工藝驗證的基礎上，制定不同的滅菌溫度和滅菌時間。此外，還要注意升溫階段、降溫階段，與保溫階段同樣有滅菌效果。,滅菌溫度、時間對培養(yǎng)基的影響,發(fā)酵培養(yǎng)基各組分的性質(zhì)及作用,1、碳源：為細胞生命活

6、動提供能量以及合成產(chǎn)物的碳架。淀粉、糊精、豆油、葡萄糖、魚油屬于碳源。 2、氮源：是構成生物體的蛋白質(zhì)、核酸及其他氮素化合物的材料。黃豆餅粉、豆粕粉、玉米漿、酵母粉、硫酸銨、氨水屬于氮源。黃豆餅粉、酵母粉為有機氮源，硫酸銨為無機氮源。3、無機鹽：硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、硫酸鎂。4、微量元素：氯化鈷。5、其它輔料：淀粉酶、抗生素 、消泡劑等。,,消毒、發(fā)酵指標及常用參數(shù),1、效價：抗生素是一種生理活性物質(zhì)，其活性常用特定的單

7、位---“效價”來表示，它是衡量抗生素有效成分的尺度，也是衡量其抗菌性能的標志。常用單位/毫升（r/ml）或單位/毫克（u/mg）來表示。,2、PH值 要想得到比較理想的發(fā)酵單位，必須重視消前、消后、發(fā)酵過程中PH值的控制，即應將PH值控制在抗生素產(chǎn)生菌的生長繁殖及合成抗生素的最適合的PH值范圍內(nèi)。,3、發(fā)酵液體積 （一）理論放罐體積=發(fā)酵罐空罐體積×裝料系數(shù) 空罐體積=π×內(nèi)半徑的

8、平方×罐體高度+下封頭容積 （二）放罐體積=（一、二級種子液+發(fā)酵罐消后體積+ 全程補料液體積）-蒸發(fā)量,放罐總億和發(fā)酵指數(shù),根據(jù)發(fā)酵效價、體積、與泡沫系數(shù)，計算發(fā)酵產(chǎn)物的總億效價實體積／虛體積=泡沫系數(shù)虛體積×泡沫系數(shù)=實體積實體積×放罐效價=發(fā)酵總億發(fā)酵指數(shù)是衡量發(fā)酵水平的技術指標。 平均發(fā)酵單位×平均放罐體積發(fā)酵指數(shù)= ——————————

9、————— 平均發(fā)酵周期×發(fā)酵罐空罐體積發(fā)酵指數(shù)單位（發(fā)酵液總億/小時·m3）,消后體積的重要性,對于種子罐、發(fā)酵罐、補料罐消毒體積的要求，必須保證碳、氮比例協(xié)調(diào)，符合工藝規(guī)定的消后指標。對于種子罐的消后體積，體積過小，移入下級罐的接種量偏低，使產(chǎn)生菌生長代謝緩慢，起步單位低；體積過大，容易起沫染菌，不利于正常生產(chǎn)。對于補料罐的消后體積，主要控制計料液的含糖量。,發(fā)酵罐消后體

10、積的重要性（題解2）,對于發(fā)酵罐的消后體積，除了要保證工藝條件外，還需考慮裝料系數(shù)（理論放罐體積）和全程補料量，過大的體積會造成許多不利之處： 1、體積過大，容易造成逃液。2、容易污染雜質(zhì)，影響發(fā)酵水平。3、空氣利用不好，影響溶氧。 相反，體積過小，使放罐體積變小，發(fā)酵總億達不到要求，產(chǎn)量偏低，設備利用率差，成本偏高。,無菌空氣系統(tǒng),1、無菌空氣在發(fā)酵生產(chǎn)中的作用： 產(chǎn)生抗生素的微生物大多數(shù)是好氧菌（需氧

11、菌），整個發(fā)酵過程需要不斷通入無菌壓縮空氣，為微生物生長代謝持續(xù)供氧，并維持罐壓防止外界雜菌侵入。2、無菌空氣的重要性： 空氣系統(tǒng)帶菌造成的染菌約占染菌總數(shù)的20%，合理設計、安裝空氣凈化設備，嚴格按無菌制度和操作規(guī)程使用空氣，是保證空氣無菌的關鍵。3、無菌空氣的預處理： 空氣中含有水分、塵埃、細菌，需要經(jīng)過除水、多級過濾除菌等處理過程，方可用于發(fā)酵生產(chǎn)。,無菌空氣系統(tǒng)工作流程,,,空氣冷卻器,旋風分

12、離器,空氣加熱器,總 過 濾 器,,,,,,,,,,,,,,無菌空氣的制備—壓縮,空氣經(jīng)空壓機壓縮后，壓強和溫度提高，相對濕度下降，但濕含量不變，露點比壓縮前提高，也就是下一步空氣經(jīng)冷卻后很容易達到露點而析出水。如下表：,無菌空氣的制備—冷卻,壓縮空氣經(jīng)冷卻后，壓強不變、溫度降低，相對濕度提高，濕含量降低，且溫度降低到露點以下、相對濕度100%時，水分析出。如下表：,無菌空氣的制備—除水和加熱,壓縮空氣冷卻到露點以下后，空氣中水分析出，

13、由于空氣在管道中流速較大，水滴或霧滴被空氣所夾帶，通常采用旋風分離器利用離心力除掉水滴及較重微粒。,無菌空氣的制備—加熱器,從除水設備中出來的空氣，相對濕度仍達100%，直接進行過濾會浸濕過濾介質(zhì)，影響過濾效果。因此需將空氣進行加熱升溫，降低相對濕度，保證空氣以較干燥狀態(tài)進入過濾器。,無菌空氣的制備—過濾,空氣中含有細菌、霉菌孢子、酵母菌、噬菌體、病毒等微生物，其中細菌芽胞和霉菌孢子較多，大小為0.5-1μm，附著在塵埃和霧沫上，因此只

14、要將大于0.5μm的塵埃粒子除去，即可達到無菌要求。 一般經(jīng)兩級總過濾器、一級預過濾器、一級精過濾器的分級過濾，可獲得符合要求的無菌空氣。,典型發(fā)酵罐及管道、閥門組成？（題解3）,典型的發(fā)酵罐包括罐體、上下封頭、人孔、傳動裝置（包括減速機或皮帶輪、軸承箱、軸封、傳動軸、聯(lián)軸器、拉筋、攪拌漿）、蛇管或夾層、燈孔、視鏡孔、接種口、壓力表等儀表接口、溫度計管（溫度傳感器）、電極座（PH、ＤＯ）、擋板等。發(fā)酵罐附屬的管道按功能

15、分為進放料管道、進氣排氣管道、取樣管道、沖視鏡管道、間接冷卻加熱管道、消泡劑管道、移種管道、補料管道、通氨管道等系統(tǒng)。,,截止閥特點：,也叫球心閥，截閥。優(yōu)點：密封面摩擦力小、耐用；嚴密性能好、易于開關、維修方便；開啟高度可以使用絲扣拉桿控制，易于調(diào)節(jié)流量；耐受高溫及壓力，不易損壞。缺點：截止閥閥芯阻力大，影響流量和流速；截止閥不易于在黏稠的物料中使用，這樣會造成閥門的密封面不嚴密而泄漏；截止閥安裝時有方向性，逆向安裝會造成阻力更大，但

16、在發(fā)酵罐的連接上，必須注意與發(fā)酵罐為正向，與管路流向為逆向安裝。,針形閥特點,一般是用來控制微量調(diào)節(jié)的小型閥門，它的一般通徑有15mm和10mm兩種。優(yōu)點：耐受高溫、高壓、不易腐蝕；易于控制微量流速和流加、滴加補料；操作方便，易于更換。缺點：易于損壞，尤其是閥頭容易掉頭；因為結構小，通道小，所以容易被堵塞。,旋塞閥特點,也稱考克，是一種不耐受高溫和高壓，但又易于操作的閥門。材質(zhì)一般以鑄鐵為主，這就決定了它不能耐受高溫（一般要求小于等于

17、100 ℃）和高壓，不能猛力開關，以免扭斷、變形。,球形閥特點,也稱球閥。特點：流體阻力小，流量大，極小有壓差的表現(xiàn)；不受安裝的方向性的制約；能耐受高溫高壓，耐腐蝕，嚴密性好，閥體本身不存在死角，結構簡單，極少有滲漏點。缺點：不能做微量調(diào)節(jié)使用，最好是全開或全閉；盡管能耐受高溫，也不要在長期高溫管路上使用。,手動隔膜閥特點,也稱隔閥，它是依靠橡膠隔膜和聚四氟隔膜，通過手動拉桿的緊密壓合而達到開啟和密閉的。特點：流體阻力小，流速不受影響；

18、可以在黏稠或有顆粒的介質(zhì)上；介質(zhì)不會于閥頭部分接觸，因此不存在閥頭填料密封處泄漏的弊端；結構簡單耐受腐蝕。缺點：除特制的耐高溫高壓的隔膜閥外，一般的手動隔膜閥不耐受高溫高壓，一般公稱壓力在6Kgf/cm2 ，溫度為80℃，最高耐受溫度180℃；容易損壞，滲漏，變形；必須定期更換隔膜閥墊。,止回閥特點,又稱止逆閥、單向閥等。止回閥是依靠液體本身的動力自動啟閉閥門，它的作用是阻止介質(zhì)的逆向流動。 特點：介質(zhì)在閥體內(nèi)單向流動，阻止介質(zhì)倒流；

19、耐受高溫、高壓，不易變形。缺點：不能使用在黏稠和有顆粒的物料介質(zhì)上，因為止回閥的密封面一旦有黏稠物或有顆粒物的時候，止回閥就會失去單向的意義，起不到防止物料倒流的作用；不能使用在有腐蝕性介質(zhì)的管路上。,染菌率的計算,以發(fā)酵總罐批為基準, 染菌罐批應包括染菌重消后的重復染菌的罐批。發(fā)酵總過程(全周期)無論前期或后期染菌,均作“染菌”論處。 發(fā)酵罐染菌罐批染菌率(％)＝－－－－－－－－－－X1

20、00% 總投罐批,題解4--設備造成染菌的原因,空氣分布管安裝不合理 。排氣與排污管道相互串聯(lián)在一起。補料管道安裝不合理造成死角。分蒸汽管路進汽位置不合適，滅菌時“短路”。管道中的閥門和法蘭、絲扣等滲漏。罐體穿孔或罐內(nèi)冷卻管穿孔。軸封泄漏。,題解5--空氣過濾器注意事項?,（1）加強預過濾器的檢查，加強蒸汽過濾器的檢查。（2）壓降超標停止使用。 （3

21、）安裝新過濾器濾芯前嚴格檢查濾層有無破損。（4）保證空氣濕度在60%以下，防止?jié)窨諝庠斐蔀V芯過濾效果下降。（5）嚴禁培養(yǎng)基倒流入空氣過濾器。（6）滅菌時嚴禁空氣、蒸汽同時使用，嚴禁超溫超壓，送空氣時要緩慢。（7）滅菌完要使蒸汽冷凝水徹底排凈、吹干后使用。（8）總過濾器濾芯采用自凈方式處理，不得用蒸汽消毒。,題解6-7,使用蒸汽前必須排盡蒸汽管道內(nèi)的冷卻水？  蒸汽管道內(nèi)的冷凝水夾帶著少量鐵銹及雜物，

22、如不將其排盡，在通蒸汽時會直接引入罐內(nèi)，引起閥門開啟失靈，另外還會使消后體積不準，尤其是消空氣濾芯更應排盡水。滅菌操作中為什么要以溫度為主，壓力為輔進行控制？  一般情況下，滅菌時達到一定罐壓即表示溫度也到了，但是若僅控制罐壓，則并不安全可靠，因操作不當可能會出現(xiàn)虛假罐壓，所以滅菌操作中必須要以溫度為主，壓力為輔進行控制。,題解8,消毒前空罐的準備包括哪些內(nèi)容？  （1）罐內(nèi)外設備的檢查，罐內(nèi)

23、傳動設備、罐內(nèi)管路有無穿孔、堵塞、斷裂，罐外設備、管路檢查無泄露、堵塞、閥門換墊。（2）罐內(nèi)死角的清除。 （3）罐體焊縫、閥門、法蘭的嚴密度檢查，防止泄露。,題解9消毒工應具備哪些能力？,（１）良好的身體素質(zhì)和心理素質(zhì)。（２）精細的操作能力和多工種綜合知識。（３）迅速反應能力和敏捷的思維。（４）具備強烈的安全、環(huán)保意識以及無菌觀念。（５）團隊意識強，具備合作能力。（６）學習能力強，善于分析總結和文字語言表達。（

24、７）能夠做到“三勤”即“腿勤、嘴勤、手勤”,題解10：簡述濕熱滅菌的機理和影響因素？,滅菌機理：濕熱滅菌法是借助于蒸汽釋放的熱能使微生物細胞中的蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學鍵特別是氫鍵破壞，引起不可逆的變性，造成微生物死亡。影響因素：1、滅菌溫度：提高滅菌溫度，雜菌的死亡速度增加。2、滅菌時間：適當提高滅菌時間，可保證滅菌效果，對培養(yǎng)基破壞程度也隨之加大。3、雜菌菌量：菌量增加，雜菌的耐熱性提高，滅菌難度加大。4、PH值的

25、影響：培養(yǎng)基的PH值越低所需滅菌時間越短。5、培養(yǎng)基成分：脂肪、糖類、蛋白質(zhì)類培養(yǎng)基中的雜菌耐熱性增加，高濃度鹽類、色素則削弱雜菌的耐熱性。6、泡沫：培養(yǎng)基起泡，使微生物藏在泡內(nèi)，形成隔離層，導熱效果差，滅菌難度加大。7、培養(yǎng)基顆粒：顆粒過大互相粘結成塊狀，難以完全殺滅其中雜菌，必須過濾除去大顆粒，并嚴禁團狀物出現(xiàn)。,制服染菌的要點（補充）,1.種子帶菌或懷疑種子帶菌 9.64 8.接種管穿孔。

26、 0.292.接種時罐壓降至大氣壓力 0.19 9.閥門泄漏 1.453.培養(yǎng)基消毒不透 0.791 10.攪拌軸封的泄漏 2.094.總空氣系統(tǒng)帶菌 19.6 11.罐蓋泄漏 1.54

27、5.泡沫升至罐頂 0.48 12.其它設備泄漏 10.136.夾套穿孔 12.36 13.操作問題 10.157.蛇管穿孔 5.89 14.原因不明

28、 24.91 從上表可以看出的抗生素發(fā)酵染菌原因分析的統(tǒng)計資料看,空氣凈化系 統(tǒng)帶菌是導致染菌的主要因素。但仔細分析,設備穿孔和滲漏等造成的染 菌占33.85％，占第1位。,發(fā)酵代謝的常規(guī)分析曲線（了解）,代謝參數(shù)（了解）,,OUR：菌體代謝耗氧速率 CER：二氧化碳釋放率 RQ ：呼吸商 KLa：氧傳遞系數(shù),謝謝！,人有了知識，就會具備各種分析能力，明辨是