illumina測(cè)序基礎(chǔ)知識(shí)資料

1、第一個(gè)要給大家講的，是它這個(gè)flowcell。Flowcell翻成中文，就叫“流動(dòng)池”。我們來(lái)看這個(gè)圖片。圖片當(dāng)中，我們看到一個(gè)象載玻片大小的芯片。這個(gè)芯片里面，是做了8條通道。在這個(gè)通道的內(nèi)表面，是做了專門的化學(xué)修飾。它的化學(xué)修飾，主要是用2種DNA引物，把它（2種DNA引物）種在玻璃表面。這兩種（DNA引物的）序列是和接下來(lái)要測(cè)序的DNA文庫(kù)的接頭序列相互補(bǔ)的。而且這2種引物是通過(guò)共價(jià)鍵，連到Flowcell上去。之所以要用共價(jià)鍵連

2、到Flowcell上去，是因?yàn)榻酉聛?lái)有大量的液體要流過(guò)這個(gè)Flowcell，只有有共價(jià)鍵連接的這些DNA，才不會(huì)被沖掉。這就是Flowcell。文庫(kù)制作再接下來(lái)，講一下文庫(kù)、和文庫(kù)的制作（過(guò)程）所謂的DNA文庫(kù)，實(shí)際上是許多個(gè)DNA片段，在兩頭接上了特定的DNA接頭，型成的DNA混合物。文庫(kù)有2個(gè)特點(diǎn)，第1個(gè)特點(diǎn)，是當(dāng)中這一段插入的DNA，它的序列是各種各樣的。第2個(gè)特點(diǎn)，它的兩頭的接頭序列，是已知的，而且是人工特地加上去的。要做這個(gè)文

3、庫(kù)，首先是把基因組DNA，用超聲波打斷。然后打斷之后，兩頭用酶把它補(bǔ)平，再用Klenow酶在3’端加上一個(gè)A堿基。然后，再用連接酶把這個(gè)接頭給連上去。連好了接頭的DNA混合物，我們就稱為一個(gè)“文庫(kù)”。英文也稱作“l(fā)ibrary”。橋式PCR做好了Library之后，就要做橋式PCR了。橋式PCR，實(shí)際上是把文庫(kù)種到芯片上去，然后進(jìn)行擴(kuò)增，這樣的一個(gè)過(guò)程。那么，在測(cè)序的時(shí)侯，加入進(jìn)去的，最主要是2個(gè)東西：一個(gè)是帶熒光標(biāo)記的dNTP。而這個(gè)

4、dNTP，它還有一個(gè)特點(diǎn)，它的3’末端是被一個(gè)疊氮基堵住的。然后，再加一個(gè)聚合酶，聚合酶就會(huì)選擇：哪一個(gè)dNTP是和原來(lái)位置上的那個(gè)堿基是互補(bǔ)的，根據(jù)互補(bǔ)性原理，把這個(gè)dNTP合成到新的這個(gè)DNA鏈上去。因?yàn)檫@個(gè)dNTP的3’端是被一個(gè)疊氮基團(tuán)堵住了，所以，它一個(gè)循環(huán)只能延長(zhǎng)一個(gè)堿基。然后，它就停在那兒了。合成完了之后，就用水把多余的dNTP和酶給沖掉。沖掉之后，就放到顯微鏡下，去進(jìn)行激光掃描。根據(jù)發(fā)出來(lái)的熒光來(lái)判斷它是哪個(gè)堿基。因?yàn)?

5、種dNTP，它每一種dNTP上面標(biāo)的熒光素都不一樣，根據(jù)紅、黃、藍(lán)、綠，它出來(lái)的哪種顏色，那么，就可以倒過(guò)來(lái)推出來(lái)，這個(gè)新合成上去的堿基，是哪種堿基。因?yàn)樾潞铣傻膲A基，是和原來(lái)位置（的堿基）是互補(bǔ)的，所以，又推出模板上那個(gè)堿基是哪個(gè)。這一個(gè)循環(huán)完成之后，就加入一些化學(xué)試劑，把疊氮基團(tuán)和旁邊標(biāo)記的熒光基團(tuán)切掉。切完了之后，3’端的羥基就暴露出來(lái)。再接下來(lái)，加入新的dNTP和新的酶，然后，又延長(zhǎng)一個(gè)堿基。新延長(zhǎng)完一個(gè)堿基之后，把多余的酶和d