生殖毒性課案

1、第十七章 生殖毒理學(xué),西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院雷榮輝 leirh@mail.xjtu.edu.cn,生殖毒理學(xué)的概念,生殖毒理學(xué)是研究化學(xué)因素及物理因素對男(雄)性和女(雌)性生殖系統(tǒng)有害生物效應(yīng)的一門毒理學(xué)分支科學(xué)。生殖毒性可導(dǎo)致男 (雄) 性或女 (雌) 性生殖器官、相關(guān)內(nèi)分泌系統(tǒng)、性周期和性行為以及生育力和妊娠結(jié)局的改變。,生殖毒理學(xué)的近代史,1950年美國霍普金斯大學(xué)醫(yī)院發(fā)現(xiàn)，懷孕期間服用黃體酮，先后有600多名女嬰出現(xiàn)生殖

2、器男性化畸形 。1956年用于治療妊娠反應(yīng)的反應(yīng)停，1961年后出現(xiàn)近萬例短肢畸形兒(海豹畸形)。1968年日本米糠油事件1999年 比利時發(fā)生的二惡英(Dioxins)公害事件。,美國研究人員發(fā)現(xiàn)佛羅里達州阿波普卡湖中鱷魚自從 DDE 泄漏事件后數(shù)量急劇減少，繁殖率明顯下降，并發(fā)現(xiàn)部分雄性鱷魚血漿中睪酮濃度明顯降低、陰莖長度只有正常長度的1/4，且伴有睪丸組織結(jié)構(gòu)的改變等; 雌鱷排出卵中未受精卵的比例顯著上升。,2002年7月1

3、8日中科院水生生物研究所公布了一項研究成果,東湖部分魚類因長期遭受污染,出現(xiàn)雄魚雌性化.,生活污水,洗滌劑,塑料制品,,,酞酸酯烷基酚類化學(xué)物,1992年以來，Carlson等相繼報道近50年來成年男子的平均精子數(shù)減少近一半,同時男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常如隱睪、尿道下裂、睪丸癌等疾患的發(fā)病率升高; 女性乳腺癌的發(fā)生率近年來每年以1%的速度增長。另外,許多野生動物生殖器官發(fā)育異常, 如睪丸和外生殖器變小, 生育力下降。 并認(rèn)為這些異常改

4、變與環(huán)境化學(xué)因素有關(guān), 提出了環(huán)境雌激素、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物等概念。,1996年Theo Colborn等著Our Stolen Future 指出“環(huán)境激素” 對人類生存的地球的危害，該書被譯成15種語言在世界各地銷售。,20個國家男性精子質(zhì)量調(diào)查結(jié)果,我國39個縣市男性精子質(zhì)量調(diào)查結(jié)果,,生殖和發(fā)育功能障礙是嚴(yán)重影響人體健康的主要公共衛(wèi)生問題之一。 自發(fā)流產(chǎn)率可達全部妊娠中的50% 著床后的自發(fā)流產(chǎn)率為3

5、2%～34% 活產(chǎn)嬰兒的主要出生缺陷發(fā)生率為3%～4% 學(xué)齡兒童發(fā)育障礙率大約為12%～14%。,20世紀(jì)妊娠期間暴露己烯雌酚，嚴(yán)重影響子代生殖系統(tǒng)的發(fā)育，并使女性后代發(fā)生陰道腺癌。,孕婦（圍產(chǎn)期） EEs 子代乳腺、子宮、睪丸、前列腺癌?,1973年－1991年 美國,,,,? 41％,? 24％,?126％,外源化學(xué)物對生殖發(fā)育損害作用的特點,生殖發(fā)育過程較機體其他系統(tǒng)更為敏感；外源化學(xué)物對生

6、殖發(fā)育過程影響的范圍較為廣泛和深遠(yuǎn)。,睪丸副性腺（精囊、前列腺、尿道球腺或稱庫 柏氏腺（Cowper's腺）管道系統(tǒng) 由輸出小管、附睪（由附睪頭、附睪體、附睪尾組成）、輸精管和射精管組成。,雄性生殖系統(tǒng),嚙齒類動物還有凝固腺和包皮腺兩個副性腺,,支持細(xì)胞 (Sertoli cell)生精細(xì)胞,睪丸,曲細(xì)精管(約90%), 管壁為生精上皮,間質(zhì)組織,間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cell)供血血管其它細(xì)胞,,成年睪丸

7、功能的內(nèi)分泌調(diào)控,精原細(xì)胞(休止?fàn)顟B(tài)) 2n 有絲分裂(青春期)初級精母細(xì)胞 2n 減數(shù)分裂次級精母細(xì)胞 n 精細(xì)胞 n,精細(xì)胞轉(zhuǎn)變成成熟精子的過程精子生成或精子發(fā)生(spermatogenesis),,,,中樞神經(jīng)系統(tǒng),下丘腦,垂體,睪丸,附睪,受精,精子發(fā)生,,,,,,,GnRH,ICSHFSH,,Leydig cell

8、 ICSH 睪酮,Sertoli cell FSH ABP,抑制素,調(diào)節(jié)雄激素含量,,,,,,,,雄性生殖系統(tǒng),精子形成或精子分化(spermiogenesis),,卵原細(xì)胞(休止?fàn)顟B(tài)) 2n 有絲分裂(青春期)初級卵母細(xì)胞 2n 減數(shù)分裂次級卵母細(xì)胞 n 減數(shù)分裂 卵細(xì)胞 n 成熟卵子,,,,中

9、樞神經(jīng)系統(tǒng),下丘腦,垂體,卵巢,顆粒細(xì)胞,雌激素,卵子發(fā)生,,,,,,GnRH,LHFSH,黃體細(xì)胞 LH 催乳激素孕激素,松馳素 催產(chǎn)素,卵泡膜細(xì)胞 LH 雄激素,,,,雌性生殖系統(tǒng),,,,芳香化酶,,,,,女性生殖循環(huán),,,,,,,,,,,,,一、對下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控的毒性下丘腦和垂體在睪丸和卵巢功能的調(diào)控中發(fā)揮綜合性作用1.下丘腦 ：內(nèi)源性阿片樣物質(zhì)是GnR

10、H釋放的強抑制劑，外源性嗎啡和非麻醉性鎮(zhèn)痛劑可抑制GnRH依賴性的LH分泌,濫用麻醉劑這可引起低促性腺激素性性功能不全癥。2.垂體毒物既可以直接作用于促性腺物質(zhì)而改變促性腺激素的合成和分泌，也可間接改變垂體細(xì)胞對GnRH或生殖腺類固醇的反應(yīng)性。（西米替丁、滴滴涕、開蓬、多氯聯(lián)苯等）,生殖毒作用的靶標(biāo)與環(huán)節(jié),生殖毒作用的靶標(biāo)與環(huán)節(jié),二、對睪丸的毒性1.生精細(xì)胞 （白消胺、環(huán)磷酰胺、乙二醇等)由于只要存在干細(xì)胞，生精上皮就可以再生。

11、單個干細(xì)胞基因組中產(chǎn)生的異常性可在配子中被永存。所有干細(xì)胞的破壞相當(dāng)于女性所有卵母細(xì)胞的破壞，將產(chǎn)生永久性不育。2. Sertoli細(xì)胞：對化學(xué)抑制的敏感性居中，數(shù)量有限，在維持和調(diào)控生精過程，是很多睪丸毒物的靶。 3. leydig細(xì)胞：產(chǎn)生的睪酮對Sertoli細(xì)胞的功能及性欲和副性腺功能的完整性是非常重要的。,生殖毒作用的靶標(biāo)與環(huán)節(jié),4.影響睪丸的血流和體液平衡：睪丸的血流和體液平衡是睪丸毒物另一個潛在的作用環(huán)節(jié)。曲細(xì)精管自身

12、無脈管系統(tǒng)對缺氧效應(yīng)敏感。（5-HT或組胺、鎘鹽等）5.精子排放：指精細(xì)胞經(jīng)過胞核和胞質(zhì)的轉(zhuǎn)化重組，并從睪丸轉(zhuǎn)運至附睪形成成熟精子的全過程。精細(xì)胞的三個功能區(qū)均可成為生殖毒物攻擊的靶標(biāo)。精子胞核DNA：氧化乙烯等誘變劑；線粒體和中心粒：能量代謝損傷劑，如α-氯乙醇；高爾基體：氧化應(yīng)激損傷可影響精子的獲能和頂體反應(yīng)過程。,三、對雄性副性腺的毒性1.附睪 附睪是某些生殖毒物的潛在靶，如氯代甲烷2. 輸精管和精囊腺前列腺 雖然多

13、種毒物可導(dǎo)致精囊前列腺的大小、重量和分泌活性的降低，但這些效應(yīng)都是通過干擾雄激素的產(chǎn)生或功能而實現(xiàn)的。一般不會因此而降低生育能力。,生殖毒作用的靶標(biāo)與環(huán)節(jié),生殖毒作用的靶標(biāo)與環(huán)節(jié),四、對卵巢、子宮和陰道的毒性1.生殖細(xì)胞 ：所有卵母細(xì)胞在雌(女)性出生前就已存在，如果破壞了就沒有額外的配子可補償；最敏感的階段是卵原細(xì)胞的有絲分裂期。2. 顆粒細(xì)胞 為卵母細(xì)胞正常發(fā)育提供所需的激素和營養(yǎng)環(huán)境。3. 卵泡膜細(xì)胞 具有17α羥化酶將孕酮

14、轉(zhuǎn)化為雄烯二酮,生殖毒作用的靶標(biāo)與環(huán)節(jié),毒物對卵巢的毒作用方式：促性腺激素分泌不足、卵泡發(fā)育障礙或膽固醇合成障礙均可導(dǎo)致卵巢萎縮，并繼發(fā)性引起子宮和陰道萎縮； 如可卡因、環(huán)磷酰胺、多環(huán)芳烴、無機汞等。某些化學(xué)物是雌激素和孕酮的拮抗劑或激動劑引起卵巢萎縮；如他莫昔芬、甲氧基醋酸孕酮等。血清促性腺激素水平升高或卵巢膽固醇激素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)失靈均可引起排卵周期異常。如外源性LH、FSH催乳素等。,外源化學(xué)物對雄性生殖系統(tǒng)的毒作

15、用及其表現(xiàn),對睪丸的毒性,直接損傷睪丸中的細(xì)胞群,對精子發(fā)生的有害作用,繼發(fā)性影響精子發(fā)生,改變下丘腦－垂體功能,,精子生成障礙：Leydig cell 功能異常, 有關(guān)激素合成或作用發(fā)生改變性欲異常, 陽痿及喪失生育能力引起生殖細(xì)胞突變, 造成可遺傳損害。,生殖毒作用的靶標(biāo)與環(huán)節(jié),,外源化學(xué)物對雌性生殖系統(tǒng)的毒作用及表現(xiàn),對下丘腦－垂體系統(tǒng)的損害: 閉經(jīng)/動情抑制,受孕力降低,對卵巢的損害,卵母細(xì)胞數(shù)↓/突變生長卵泡和成熟卵泡 排卵

16、抑制,受孕力↓卵巢功能提前衰退干擾卵巢內(nèi)分泌 影響受精/著床/胚胎發(fā)育,生殖道的損害: 影響運送卵子/受精/受精卵發(fā)育,常見生殖損害的表現(xiàn),性欲和性交能力↓,受孕力↓,月經(jīng)紊亂,閉經(jīng),異常的妊娠結(jié)局(流產(chǎn)、早產(chǎn)和死產(chǎn),子代發(fā)育異常,低出生體重,圍產(chǎn)期死亡等),,生殖毒作用的機理,生殖毒物作用方式,直接作用,間接作用,細(xì)胞毒性、致癌或致突變性,結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性分子的相似性,代謝為直接作用的毒物,通過酶的修飾作用, 改變內(nèi)分泌,,,,生

17、殖毒作用的機理,受體機理,以類似內(nèi)源性生殖激素的形式通 過膜或細(xì)胞受體起作用,下丘腦－垂體機理,通過改變由下丘腦或垂體前葉腺 合成和釋放的激素,類固醇生成的抑制,酶的抑制,,生殖毒作用的分子和細(xì)胞機制,一、生殖毒作用的分子機制受體機制：以擬內(nèi)源性激素的方式，通過細(xì)胞膜上或細(xì)胞核內(nèi)受體而引發(fā)毒作用，如滴滴涕、開蓬等。影響類固醇合成：藥物、激素和化學(xué)物可通過干擾或抑制特定的酶而影響類固醇的合成?；蛲蛔兣cDNA修復(fù)：氧

18、化性損傷：生殖毒物可通過氧化應(yīng)激反應(yīng)干擾雌雄配子的受精過程。,抑制類固醇生成的物質(zhì),生殖毒作用的分子和細(xì)胞機制,二、生殖毒作用的細(xì)胞機制誘發(fā)細(xì)胞凋亡：有證據(jù)表明在多種睪丸損傷中，細(xì)胞凋亡是毒性發(fā)生的主要原因，如己二酮、硝基苯和棉酚等。如二惡英、多環(huán)芳烴等可誘導(dǎo)卵母細(xì)胞凋亡而引發(fā)卵巢毒性。干擾細(xì)胞連接：如鎘、順鉑、棉酚、己二酮等,生殖毒性的檢測和評價,一般生殖毒性實驗 方法------整體動物試驗,一代生殖毒性試驗

19、 (single generation reproductive toxicity testing) 二代生殖毒性試驗 (two generation reproductive toxicity testing) 多代生殖毒性試驗 (multigeneration reproductive toxicity testing) I、II、III段生殖毒性試驗

20、 (segment I 、II、III reproductive toxicity testing),兩性介導(dǎo)的生殖毒性終點,雄性性功能和生育力的特異終點,雌性性功能和生育力的特異終點,體外生殖毒性試驗測試方法,Sertoli 細(xì)胞原代培養(yǎng)方法Leydig細(xì)胞原代培養(yǎng)方法Sertoli細(xì)胞/Germ細(xì)胞共培養(yǎng)方法附睪上皮細(xì)胞與生精細(xì)胞共培養(yǎng)方法大鼠精囊上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法大鼠前列腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法大鼠腹側(cè)前列腺上

21、皮細(xì)胞培養(yǎng)方法人精子－子宮頸粘膜穿透試驗牛子宮頸粘膜－人精子穿透試驗倉鼠無透明帶卵母細(xì)胞穿透試驗人半透明帶試驗精子活動度測試試驗,雄性生殖毒性體外測試方法,,小鼠卵巢多層原始卵泡體外培養(yǎng)方法大鼠卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)方法人和大鼠黃體細(xì)胞培養(yǎng)方法大鼠卵巢灌流培養(yǎng)系統(tǒng)子宮頸上皮細(xì)胞體外試驗子宮頸粘膜體外毒性試驗系統(tǒng)兔乳腺細(xì)胞和人乳腺細(xì)胞系體外試驗方法,雌性生殖毒性體外測試方法,下丘腦－垂體毒性的體外方法,垂體前葉(腺垂體)細(xì)

22、胞體外試驗方法大鼠下丘腦－垂體組織連續(xù)灌流系統(tǒng),生殖細(xì)胞遺傳毒性測試方法,UDS,流式細(xì)胞技術(shù), b-dUTP標(biāo)記法,單細(xì)胞凝膠電泳,SCE, 8-OHdG定量檢測方法,染色體畸變分析,Southern雜交，F(xiàn)ISH分析, FISH分析, 微核試驗, 小鼠特異位點試驗, 小鼠可遺傳異位試驗, 顯性致死試驗,生殖毒性的檢測和評價,生殖毒性的評定,外源化學(xué)物對生殖過程作用的評定主要通過生殖毒性試驗來進行。標(biāo)準(zhǔn)生殖毒性試驗可以全面反映外源

23、化學(xué)物對性腺功能、發(fā)情周期、交配行為、受孕、妊娠過程、分娩、授乳以及幼仔斷乳后生長發(fā)育可能發(fā)生的影響。,生殖毒性的評價方法,一 試驗原則受試動物：性成熟大鼠、小鼠或家兔 劑量分組：一般設(shè)立三個劑量組和一個對照組 高劑量組:能致親代動物出現(xiàn)輕度中毒，但不出現(xiàn)死亡或死 亡率不超過10%，也不能完全喪失生育能力。 低劑量組的親代動物不應(yīng)觀察到任何中毒癥狀。 中間劑量組應(yīng)僅能出現(xiàn)極為輕微的中毒癥

24、狀。 劑量設(shè)置呈等比級數(shù)。,動物數(shù)：每組雌雄各30只，或至少有20只妊娠；染毒途徑：參照人類實際接觸途徑； 試驗期間每周應(yīng)根據(jù)動物體重并參照進食量（大鼠可按每日15～20g，小鼠每日5～10g計算）和要求的攝入劑量（mg/kg體重/日）調(diào)整飼料中應(yīng)混入受試物的數(shù)量。應(yīng)始終保持達到動物應(yīng)攝入的劑量。,試驗方案 :三代兩窩生殖實驗,F３a,F１b,F２b,F２a,F１a,雄鼠：交配前８-11周 雌鼠：交配前2周,第一次交配,第二

25、次交配,觀察三個月，喂飼普通飼料，觀察其生長發(fā)育情況,,斷乳后給予受試物８到11周,觀察三個月，喂飼普通飼料，觀察其生長發(fā)育情況,斷乳后給予受試物８到11周,觀 察 指 標(biāo),1．受孕率：反映雌性動物生育能力以及雌性動物受孕情況。 妊娠雌性動物數(shù) 受孕率= ———————— × 100%

26、 交配雌性動物數(shù) 2．正常分娩率：反映雌性動物妊娠過程是否受到影響。 正常分娩雌性動物數(shù) 正常分娩率= ————————× 100% 妊娠動物數(shù),3．幼仔出生存活率：反映雌性動物分娩過程是否正常，如分娩過程受到影響，則幼仔往往在出生4天內(nèi)死亡。

27、 出生后4天存活幼仔數(shù) 幼仔出生存活率= —————————× 100% 分娩時出生幼仔數(shù) 4．幼仔哺乳成活率：反映雌性動物授乳哺育幼仔的能力。