凝膠色譜、親和色譜研究進(jìn)展及案例

1、主講人： College of Food Science,SCAU,修德,博學(xué),求實(shí),創(chuàng)新,凝膠、親和色譜,目錄,近期中國(guó)色譜研究進(jìn)展中國(guó)色譜研究進(jìn)展中國(guó)色譜最新動(dòng)態(tài)凝膠、親和色譜案例分析凝膠過(guò)濾色譜親和色譜,一、近期中國(guó)色譜研究進(jìn)展,文章名：《近年中國(guó)色譜研究進(jìn)展》作者：張祥民1、張麗華2、張玉奎2（2003年院士）作者單位：1.復(fù)旦大學(xué) 2.中科院大連化物所發(fā)表期刊：《色譜》發(fā)表時(shí)間：2012年文章名：《近期色

2、譜研究的最新動(dòng)態(tài)和進(jìn)展》作者：白泉作者單位：西北大學(xué)發(fā)表期刊：《色譜》發(fā)表時(shí)間：2015年,1、中國(guó)色譜發(fā)展概況,色譜歸屬于分析化學(xué)中的一個(gè)分支，其出現(xiàn)及發(fā)展至今已將近 110 年。色譜技術(shù)在生物制藥、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物分子的分離分析方面都發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。20 世紀(jì)末至今，是中國(guó)色譜學(xué)科全面快速發(fā)展的重要時(shí)期。Web of Science 數(shù)據(jù)庫(kù)和“中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)”和“萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)”的檢索數(shù)據(jù)( 2011 年9 月25

3、 日檢索) 表明，1990 年至2010 年我國(guó)科技工作者在美國(guó)科學(xué)情報(bào)研究所科學(xué)引文索引收錄期刊( 即 SCI 期刊) 和中國(guó)科技期刊上發(fā)表色譜相 關(guān) 論 文 132604 篇 ( 其 中 SCI 期 刊 論 文27381 篇，中國(guó)科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)論文 105223 篇) 。,,色譜方法應(yīng)用于化學(xué)領(lǐng)域的論文數(shù)量占46%，生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域的占 21%，食品科學(xué)與技術(shù)領(lǐng)域的占 5%，材料科學(xué)、工程學(xué)、微生物學(xué)領(lǐng)域的各占 4%，環(huán)境科

4、學(xué)、光譜學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域的各占 3%，上述領(lǐng)域之外的論文比例為 8%。1990 年至 2010 年，中國(guó)科學(xué)家所發(fā)表的色譜領(lǐng)域論文總數(shù)以 28062 篇的數(shù)量居世界第三位( 第一名: 美國(guó)，71008 篇; 第二名: 日本，35 035 篇) 。2010 年發(fā)表論文 4146 篇，2011 年發(fā)表 4574 篇，排名躍居世界第一。,,涉及毛細(xì)管電泳（CE）、氣象色譜（GC）高效液相色譜（HPLC）論文增長(zhǎng)態(tài)勢(shì),2、最新動(dòng)態(tài),樣品前處理

5、膜蛋白的疏水性強(qiáng)、溶解性差和豐度低，對(duì)它的分離分析是蛋白質(zhì)組學(xué)中的一大難題。復(fù)旦大學(xué)的劉寶紅教授課題組采用殼聚糖改性的介孔泡沫石墨烯(MGF-CS)作為納米反應(yīng)器，從有機(jī)溶劑中高效富集疏水性膜蛋白并進(jìn)行原位酶解。將該技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際樣品中膜蛋白的分析鑒定，采用二維液相色譜－質(zhì)譜方法(2D-LC-MS)可鑒定 931種膜蛋白，而通常采用的水溶液中酶解法僅能鑒定 73種膜蛋白。結(jié)果表明多功能的MGF-CS對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)中膜蛋白的分析鑒定具有重要

6、的應(yīng)用價(jià)值。分子印跡技術(shù)是采用人工合成方法制備對(duì)目標(biāo)分子有特異性識(shí)別材料的技術(shù)。由于蛋白質(zhì)體積大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、易于變性，完整蛋白質(zhì)模板分子難以獲得且價(jià)格昂貴，因此限制了蛋白質(zhì)分子印跡材料的發(fā)展。中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所張麗華研究員課題組提出了一種蛋白質(zhì)抗原決定基分子印跡磁性納米材料的制備新方法?？乖瓫Q定基印跡是以目標(biāo)蛋白質(zhì)上一段特異性多肽為模板分子進(jìn)行印跡。由于模板肽段與目標(biāo)蛋白質(zhì)間存在極強(qiáng)的特異性，形成的印跡位點(diǎn)對(duì)模板肽段及目標(biāo)蛋

7、白質(zhì)均具有特異性識(shí)別能力。,,金屬有機(jī)骨架化合物（MOFs）因具有比表面積大、結(jié)構(gòu)多樣性、孔道尺寸可調(diào)、骨架可修飾、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性良好等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于分離分析等領(lǐng)域。西班牙Balearic Islands大學(xué)的 Palomino課題組利用注射器設(shè)計(jì)了一種針管式自動(dòng)磁性 （MOFs）分散固相微萃取裝置。固定相多孔整體材料作為一種新型分離介質(zhì)，由于其具有制備簡(jiǎn)便、通透性好、性能穩(wěn)定和易于修飾等特點(diǎn)而被譽(yù)為第四代色譜分離介質(zhì)。鄒漢

8、法課題組發(fā)展了一種基于光引發(fā)巰基－丙烯酸酯點(diǎn)擊聚合反應(yīng)的新方法，并成功制備了具有高分離性能的有機(jī)－硅膠雜化整體柱。與巰基－烯和巰基－甲基丙烯酸酯點(diǎn)擊聚合反應(yīng)相似，光引發(fā)的巰基－丙烯酸酯點(diǎn)擊聚合反應(yīng)不僅反應(yīng)效率較高，速度快，而且反應(yīng)條件非常溫和。加拿大卡爾加里大學(xué)的Thurbide小組將316不銹鋼粉末（粒徑44~149μm）填充于316不銹鋼毛細(xì)管柱內(nèi)作為支持體，將水泵入色譜柱中，建立了以水為固定相，CO2為流動(dòng)相，與火焰離子化檢測(cè)器

9、聯(lián)用的超臨界流體色譜分離體系（SFC-FID）。,,手性拆分德國(guó)萊比錫城大學(xué)的 Belder小組將纖維素-三（3，5－二甲基苯基氨基甲酸酯）包覆的 5μm全多孔SiO2手性固定相填充于微流控芯片的通道中，第一次利用填充的微流控芯片（柱長(zhǎng)58.4mm）實(shí)現(xiàn)了幾種手性藥物的快速拆分，對(duì)力莫敵提取物在 5s內(nèi)就可完成拆分。分析檢測(cè)澳大利亞悉尼大學(xué)的 Handelsman小組采用1,2-二甲基咪唑-5-磺酰氯作為雌激素衍生化試劑，建立了一

10、種利用LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定血清中衍生化的雌二醇(E2)和未衍生化的睪酮(T)、二氫睪酮(DHT)的高靈敏檢測(cè)方法。蛋白質(zhì)組學(xué)美國(guó) Wisconsin-Madison大學(xué)的Ge小組耦合離子交換色譜/疏水色譜/反相色譜(IEC-HIC-RPC)3種色譜分離方法，構(gòu)建了三維液相色譜(3D LC)用于整體蛋白質(zhì)的分離，并證明 3D LC(IEC-HIC-RPC)技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)的 2D LC(IEC-RPC)。,二、凝膠、親和色譜案例分析,

11、1、凝膠過(guò)濾色譜（凝膠色譜分為凝膠過(guò)濾色譜和凝膠滲透色譜）文章名：《凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定嬰兒配方乳粉中α-乳白蛋白》作者：賈云虹，宋曉青，楊 凱作者單位：河北省三元食品有限公司發(fā)表期刊：《食品科技》發(fā)表時(shí)間：2015年《食品科技》（Food Science and Technology）1975年創(chuàng)刊，北京市糧食科學(xué)研究所主辦，1996-2011年連續(xù)5屆中文核心期刊。,,背景α-乳白蛋白中富含色氨酸，色氨酸是人體

12、必需氨基酸之一。食用α-乳白蛋白和食用酪蛋白的結(jié)果相比，大腦中的色氨酸含量比例高達(dá)48%，且減弱了中性氨基酸和色氨酸在穿過(guò)血腦屏障時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)。這些依據(jù)表明，在嬰兒配方乳粉中加入富含色氨酸的α-乳白蛋白，使其接近母乳中α-乳白蛋白的含量比例，是非常必要的。,,α-乳白蛋白檢測(cè)方法,,凝膠過(guò)濾色譜：根據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離，紫外吸收檢測(cè)。能檢測(cè)出嬰兒配方乳粉中非變性和在加工過(guò)程中變性的α-乳白蛋白總量，操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高。流動(dòng)相：

13、6 mol/L鹽酸胍溶液，加入磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、EDTA，調(diào)pH=6.0，用0.45 μm濾膜過(guò)濾。色譜條件：色譜柱TSK-2000SWXL凝膠色譜柱(7.8mm×300 mm)；柱溫30 ℃；流動(dòng)相流速0.5mol/L；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。（日本TOSOH公司生產(chǎn)的TSK-2000SWXL粒度5μm，孔徑125，可以測(cè)量分子量5,000～150,000。）,,實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確稱取含有大約相當(dāng)于10 mg蛋白質(zhì)的樣品

14、，樣品溶在盛有流動(dòng)相溶液的10 mL容量瓶中，超聲處理30 min。從以上樣品中轉(zhuǎn)移1.5 mL于10mL離心管中，加入10 μL β-硫基乙醇，搖動(dòng)混合約10 s，讓樣品在室溫下放置至少2 h，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾至液相色譜進(jìn)樣瓶中，然后注射進(jìn)液相色譜。根據(jù)標(biāo)樣峰面積和濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算樣品中α-乳白蛋白含量。選擇色譜柱α-乳白蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為14200 u，而凝膠色譜柱TSK-2000SWXL分離樣品的相對(duì)分子

15、質(zhì)量范圍為5000~150000 u，因此選擇此色譜柱是比較合適的。組成蛋白質(zhì)的氨基酸在210~280 nm范圍內(nèi)都有不同程度的吸收，但只有色氨酸在280 nm有足夠高的吸收，而α-乳白蛋白含有豐富的色氨酸，因此選擇280 nm作為DAD的檢測(cè)波長(zhǎng)，能獲得較好的靈敏度。,,回歸方程和檢出限稱取適量α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，用流動(dòng)相配制成0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，按照1.3所述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃

16、度為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到α-乳白蛋白線性回歸方程：Y=8407.6X-90.26，線性相關(guān)系數(shù)：R2=0.9998。以信噪比S/N=3計(jì)算α-乳白蛋白的檢測(cè)限為2.8 μg/mL，完全能滿足嬰兒配方乳粉中α-乳白蛋白含量的測(cè)定。嬰兒配方乳粉中α-乳白蛋白含量的測(cè)定,,2、親和色譜文章名：《親和色譜應(yīng)用于天然活性成分篩選的研究進(jìn)展》作者：馮穎淑1，童珊珊2，徐希明2等作者單位：1中國(guó)藥科大學(xué) 2江蘇大學(xué)發(fā)表期刊：《中國(guó)中藥雜

17、志》發(fā)表時(shí)間：2015年,,親和色譜法( affinity chromatography) 是一種利用固定相的結(jié)合特性來(lái)分離分子的色譜方法。早在 1910 年，德國(guó)藥理學(xué)家 Starken-stein 將蔗糖酶抗體吸附在高嶺土上，研究了抗體和抗原的相互作用，為親和色譜的萌芽。1924 年，俄羅斯學(xué)者 Engelhardt提出了“固定化配體原理”，作為分離生物活性物質(zhì)的方法，為親和色譜分離方法的根本。1970 年，Cuatreca

18、ses 提出了“空間間隔臂”概念和方法，成功解決了配位體的立體可接受性問(wèn)題。1972 年，德國(guó)學(xué)者Wulff 提出分子印跡色譜方法，進(jìn)一步擴(kuò)展了親和色譜的應(yīng)用，使得親和色譜開始用于藥物篩選研究。1978 年瑞典學(xué)者 Ohlson 提出以大孔微粒硅膠作為載體的高效液相親和色譜方法，使得親和色譜的發(fā)展跨入了一個(gè)新的時(shí)代。,,親和色譜法篩選技術(shù)受體為親和配基的色譜篩選酶為親和配基的色譜篩選血漿蛋白為親和配基的色譜篩選以DNA為親和

19、配基的色譜篩選細(xì)胞膜色譜篩選脂筏色譜篩選分子印跡技術(shù)其他親和配基（如核酸適配體親和色譜、免疫親和色譜、金屬離子親和色譜等等。）,,文章名：《殼聚糖螯合凝膠層析法純化血液超氧化物歧化酶》作者：王保，全平娟 ，張永州等作者單位：河南大學(xué)，中科院生物物理研究所，蘭州大學(xué)發(fā)表期刊：《食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)》發(fā)表時(shí)間：2014年,,研究背景超氧化物歧化酶簡(jiǎn)稱 SOD，是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種可防止氧化損傷和缺失的活性酶，也是一種應(yīng)

20、用廣泛的藥用酶，具有抗衰老、預(yù)防輻射及治療炎癥等一系列功能，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)。1975 年proath首次提出固定化金屬螯合親和層析（IMAC），利用固定在基質(zhì)上的過(guò)渡態(tài)金屬離子和蛋白質(zhì)表面的組氨酸、半胱氨酸、色氨酸等殘基的配位作用，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬離子有親和力的蛋白質(zhì)的吸附和分離。在制備親和介質(zhì)時(shí)，常用的金屬離子有 Cu2+，Zn2+和 Ni2+等， 常用的螯合配基有亞氨基二乙酸 （IDA）， 三羧基甲基乙二胺（TED

21、），次氨基三乙酸（NTA）等。 固定化螯合親和色譜常常以凝膠為載體， 如在 SephadexG-75 或者DEAE-superpose 等凝膠上用化學(xué)交聯(lián)方法引入螯合劑 IDA， 再通過(guò)交聯(lián)固定和親和配 （Ba2+，Cu2+，Zn2+）。 用該方法制備的凝膠介質(zhì)生產(chǎn)成本很高，軟基質(zhì)很易被壓縮，不易被放大生產(chǎn)。近年來(lái)，隨著基因工程下游技術(shù)的發(fā)展，基因重組蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)越來(lái)越顯示其重要性， 金屬螯合層析技術(shù)（IMAC）分辨率高、選擇

22、性好，能在常規(guī)的變性條件下及非變性條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)組分分離純化。,,作者以殼聚糖為原料， 以固定相偶聯(lián)的配基-亞氨基二乙酸（IDA）及金屬離子 Cu2+發(fā)生螯合作用，制得金屬親和層析凝膠，改凝膠化學(xué)穩(wěn)定性好，基質(zhì)穩(wěn)定，容易再生，并首次以聚合高分子電解質(zhì)聚丙烯酸鈉對(duì)傳統(tǒng)血液超氧化物歧化酶提純工藝進(jìn)行改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)方法 材料：新鮮豬血，檸檬酸三鈉，氯化銅，丙酮，聚丙烯酸（PAA），不同相對(duì)分子質(zhì)量聚丙烯酸鈉（PAAS），固含 3.45%（質(zhì)

23、量分?jǐn)?shù)）；殼聚糖，脫乙酰度≥90%，；SOD 活性試劑盒， 低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，SOD 標(biāo)準(zhǔn)品，臨苯三酚，SephedexG-75，DEAE-sepherose-fast flow4B。實(shí)驗(yàn)步驟,SOD的制備,殼聚糖制備凝膠,Cu2+螯合、平衡和SOD純化,SOD 凝膠過(guò)濾層析純化,SOD 離子交換層析純化,SOD活力測(cè)定,蛋白質(zhì)含量測(cè)定,,,,,,,,,SDS-PAGE 聚 丙烯 酰胺 凝膠 電泳,酶滋味光譜測(cè)定,,結(jié)果分析