病毒鑒定的方法科四第5組

1、病毒的檢測手段和方法在不斷發(fā)展和改進(jìn)，但無論是什么樣的方法，病毒所共有的兩個(gè)特性而發(fā)展起來的：一是病毒的侵染性。二是病毒作為核蛋白的特性，也就是病毒理化性質(zhì)。,,,病毒鑒定的方法：,1、電子顯微鏡檢測法2、電鏡復(fù)染檢測法3、免疫電鏡檢測法4、血清學(xué)檢測法5、酶標(biāo)免疫吸附法6、基因檢測技術(shù)7、蛋白指紋圖譜,1、電子顯微鏡檢測法 電子顯微鏡技術(shù)是最直接，最準(zhǔn)確的檢測病毒的手段，

2、它可以直接看到病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)、存在與否，所以在進(jìn)入了分子水平的今天它仍然有著不可替代的作用。 原理：電子顯微鏡以電磁波為光源, 將感病植物組織制成檢測樣本, 利用短波電子流, 在電子顯微鏡下觀察, 可根據(jù)病毒的形態(tài)、大小、內(nèi)含體以及染病組織超微結(jié)構(gòu)等診斷病毒的種類。,,返回,2、電鏡負(fù)染檢測法 電鏡負(fù)染技術(shù)是20世紀(jì)60年代開始使用于英國試驗(yàn)室，其圖像如同一張照相的底片，因此人們習(xí)慣地稱為負(fù)染色，電鏡負(fù)染技術(shù)也就由此

3、而生。 原理：一些重金屬離子能繞核蛋白體四周沉淀下來，形成一個(gè)黑暗的背景，在核蛋白體內(nèi)部不能沉積而形成一個(gè)清晰的亮區(qū)，由此辨別病毒。,返回,3、免疫電鏡檢測法 免疫電鏡技術(shù)是將免疫學(xué)原理與電鏡負(fù)染技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，在電鏡制樣過程中，于銅網(wǎng)上先鋪展一層細(xì)胞色素A，稍后再添加一滴抗體，多余液滴用濾紙吸掉，最后點(diǎn)上一滴抗原和染液，由于細(xì)胞色素A的作用，減少了樣品即抗體、抗原的表面能力，能形成均勻的涂層。

4、 原理：在電鏡制樣過程中，病毒顆粒不能集中的沉積在有效的電鏡視野內(nèi)，而容易造成電鏡觀察時(shí)的疏漏，免疫電鏡法利用了抗體、抗原的親和性與吸附性的這一特點(diǎn)，使病毒能較集中地沉集在有效視野內(nèi)，從而便于電鏡下的觀察，提高了檢測幾率。,返回,4、血清學(xué)檢測法 動物受其致病細(xì)菌、病毒侵染后，動物體內(nèi)血液中的球蛋白發(fā)生變化而產(chǎn)生抗體，引起動物產(chǎn)生抗體的物質(zhì)簡稱為抗血清。由于不同病毒產(chǎn)生的抗血清都有各自的特性, 因此可以用已知病毒的抗

5、血清來鑒定病毒種類。 原理：病毒是由蛋白質(zhì)和核酸組成的核蛋白是一種很好的抗原, 血清中的抗體能與同系的抗原在體外特異的結(jié)合，使抗原失去活力。,返回,5、酶標(biāo)免疫吸附法 該方法最早用于動物病毒的檢測，近二三十年才應(yīng)用于植物病毒的檢測，并作為病毒的定量方法廣泛應(yīng)用于病理、免疫學(xué)的研究和生產(chǎn)實(shí)踐中，對病毒進(jìn)行快速檢測。此法的最大優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，很多的病毒因其濃度太低或某種抑制劑的干擾，常規(guī)血清學(xué)方法檢測不出時(shí)，此法就顯

6、示出獨(dú)特的優(yōu)越性。 原理：將同源特異抗體吸附在反應(yīng)器皿底部，加入欲測試的含病毒的樣品，病毒與抗體結(jié)合，病毒顆粒被固定，再加入酶標(biāo)記的特異抗體和酶的底物，酶與底物反應(yīng)后會出現(xiàn)有顏色的溶液其強(qiáng)度與病毒濃度成正比，用此方法可測定出病毒的濃度。,返回,6、基因檢測技術(shù) 基因檢測技術(shù)對病毒的檢測已經(jīng)達(dá)到分子水平，其靈敏度和特異性是任何生化方法的檢測所不能比擬的，同時(shí)可以省略大量的病毒提純和血清的制備工作。 原理:（

7、1）分子探針雜交檢測技術(shù)，利用一定序列的核苷酸合成探針，通過分子雜交技術(shù)，檢測出供試樣品中與之相補(bǔ)的堿基序列。 （2）PCR技術(shù)是通過體外擴(kuò)增可以使供試樣品中的目的基因片段很快擴(kuò)增，使之達(dá)到了對即使是病毒含量極低的樣品，也能靈敏準(zhǔn)確地得到定性的結(jié)果。,返回,PCR技術(shù)： 原理：PCR技術(shù)是一種在體外將特異性DNA序列進(jìn)行高效擴(kuò)增的方法。PCR擴(kuò)增DNA片斷的特異性是由兩個(gè)人工合成的寡核昔酸引物的順序決定的,引物位于靶

8、DNA的兩側(cè),并分別和相對DNA鏈互補(bǔ)。 步驟:①將待擴(kuò)增標(biāo)本(靶DNA)在高溫下變性, 雙鏈解離;②降低溫度,使兩引物結(jié)合到靶D NA上,兩個(gè)引物與靶DNA解鏈后的正負(fù)鏈互補(bǔ);③在合適溫度條件下,在DNA多聚酶的催化下,引物引導(dǎo)DNA合成。,PCR技術(shù)：運(yùn)用：A、用于遺傳性疾病，如鐮狀紅細(xì)胞貧血的診斷； B、用于艾滋病的檢測：目前艾滋病的診斷主要采用血清學(xué)方法檢查抗體,用PCR技術(shù)可在HIV感染早期血清未出現(xiàn)抗體

9、之前于血清中測得HIV-DNA,也可從病人外周血白細(xì)咆中測得極微量HIV-DNA。 C、用于乙型肝炎的檢測； D、用于輪狀病毒的檢測: 輪狀病毒為嬰幼兒急性病毒性胃腸炎的主要病原,PCR用于檢測糞便中的輪狀病毒比核酸雜交法, 敏感性提高5000倍。,返回,7、蛋白指紋圖譜法 原理：不同病毒蛋白通過一維sDs一PAGE分離能形成各自獨(dú)特的蛋白質(zhì)帶型(或指紋圖譜)。病毒在感染細(xì)胞內(nèi)繁殖時(shí)，用高濃度NaCI特異

10、抑制感染細(xì)胞自身的蛋白合成，分離病毒蛋白后進(jìn)行一維sDs一PAGE即可形成蛋自帶型(或指紋圖譜)，將待測病毒蛋白指紋圖譜與電腦內(nèi)病毒蛋白指紋圖參考軟件相比較即可鑒定未知病毒。 步驟:(1)培養(yǎng)病毒經(jīng)抑制宿主細(xì)胞合成后進(jìn)行同位素標(biāo)記。 （2）sDs一PAGE分離病毒蛋白。 （3）通過膠掃描對病毒蛋白指紋圖譜定位。 （4）抽提蛋白質(zhì)且以數(shù)字的形式將蛋白指紋圖存入電膊硬盤，最后將未知病毒蛋自指紋圖與電