梅毒實驗室檢測技術(shù)剖析

1、梅毒實驗室檢測技術(shù),,梅毒控制規(guī)劃中期評估-梅毒實驗室檢測知識調(diào)查（1）,1.一旦感染梅毒，梅毒螺旋體特異性抗體通常會終身陽性 2.RPR/TRUST只能用于梅毒初篩3. 二期梅毒時，TPPA和RPR兩種血清學(xué)試驗100％陽性4.接受抗梅治療的嬰兒，隨訪18個月后TPPA （+）/RPR（- ）可確診為胎傳梅毒 5.常規(guī)梅毒血清學(xué)檢測的是IgG抗體，不能檢測到IgM抗體6.TPPA（- ）/ RPR（+）結(jié)果一般可排

2、除梅毒螺旋體感染 7. TPPA滴度檢測是臨床治療梅毒效果評價的重要參考指標(biāo),2,梅毒控制規(guī)劃中期評估-梅毒實驗室檢測知識調(diào)查（2）,8. 新生兒血清TPPA（+）/ RPR（+），可診斷為先天梅毒9.梅毒初篩可采用任何一種血清學(xué)檢測方法10. RPR和TRUST的方法原理相同，所以兩種方法的定量試驗滴度結(jié)果一定一致11. TPPA（+）/ RPR（-）可能是極早期梅毒12. ELISA法檢測陽性，TPPA復(fù)檢陰性，最終結(jié)果

3、報告：TPPA試驗陰性，解釋ELISA法為假陽性。,3,實驗室檢測的目的？,早期發(fā)現(xiàn)臨床診斷有效治療精準(zhǔn)醫(yī)療疫情報告,,檢測方法檢測策略,,結(jié)果的解讀和合理應(yīng)用醫(yī)生、檢驗、防保,,結(jié)果如何解讀和合理應(yīng)用,,,,,,,,,,,,,,,,,,如何發(fā)揮實驗室檢測作用,實驗室檢測 實驗室診斷艾滋病檢測策略最新進展（2015） 確證（診）試驗 → 補充試驗 陽、陰性→有、無反應(yīng) 增加了各種檢測

4、策略 強調(diào)臨床診斷,≠,梅毒是一個可以臨床治愈的傳染病,病例診斷依據(jù)病史癥狀實驗室檢查實驗室檢查結(jié)果對梅毒診斷及判愈有決定性意義,如和達到實驗室檢測的基本要求,檢測方法檢測策略質(zhì)量保證,,管理層面（行政、疾控）生產(chǎn)廠家醫(yī)療機構(gòu)（醫(yī)生、檢驗、防保）,常用梅毒實驗室檢測方法,檢測方法,病原學(xué)檢測梅毒螺旋體血清學(xué)試驗非梅毒螺旋體血清學(xué)組織病理學(xué)檢測白細(xì)胞檢測蛋白檢測,,未經(jīng)治療的梅毒病人的自然病程,,,

5、,感染梅毒螺旋體,一期梅毒,二期梅毒,隱形梅毒,三期梅毒,72%,30%,終生隱形梅毒,,,,,中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染,,28%,感染梅毒螺旋體,2-6周,1-3月,1-3月,2-50年,,,,病原學(xué)檢查,原理：一期、二期梅毒時，取硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損部位組織液或淋巴結(jié)穿刺術(shù)得到的組織液，在暗視野顯微鏡下，光線從聚光器的邊緣斜射到涂片上的梅毒螺旋體而發(fā)出亮光，從而可根據(jù)其特殊形態(tài)和運動方式進行檢測。方法：（1）暗視顯微鏡檢查

6、 （2）鍍銀染色法 （3）核酸檢測（血液標(biāo)本？）注：梅毒螺旋體目前體外人工培養(yǎng)還沒有獲得成功，僅能通過接種兔睪丸等部位進行有限增殖。,,病原學(xué)檢查的臨床意義,螺旋體檢查是診斷早期梅毒的最佳方法，對于患者的早期診斷、及時治療、預(yù)后和盡早切斷傳染源都有十分重要的意義。如未見到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性。,梅毒血清學(xué)檢測方法,(1) 非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗 （非特異性梅毒抗體）(2)

7、 梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗 （特異性梅毒抗體）兩類方法。問題： 為什么梅毒診斷需要上述兩類血清學(xué)檢測方法？,,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗原理,梅毒螺旋體一旦感染人體，宿主可對螺旋體表面的脂質(zhì)作出免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗類脂抗原的抗體（非特異性抗體）。未經(jīng)治療的病人，其血清內(nèi)的非特異性抗體可長期存在。經(jīng)正規(guī)治療后，非特異性抗體可以逐漸減少滴度至轉(zhuǎn)為陰性。中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) WS/T491—2016:梅毒非特異性抗體檢測操作

8、指南２０１６-０７-０７發(fā)布 ２０１６-１２-１５實施,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)原理,方法包括： （1）快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗 (RPR) （2）甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST） （3）性病研究實驗室試驗 (VDRL)等?；境煞质切牧字?卵磷脂和膽固醇抗原抗體結(jié)合形成復(fù)合物，凝集成網(wǎng)狀沉淀顆粒被肉眼所見上述方法的敏感性和特異性都基本相似,非梅毒螺旋

9、體抗原血清學(xué)試驗原理示意圖,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗操作要點,1、儀器：水平旋轉(zhuǎn)儀，轉(zhuǎn)速？轉(zhuǎn)幅？,2、定性試驗加樣：吸取0.05mL血清(漿)放在卡片圈中， 并均勻地涂布在整個圈內(nèi)加抗原：將抗原輕輕搖勻，用9號針頭加1滴抗原反應(yīng)：水平旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)8分鐘(23 ℃ -29 ℃） ，亮光下觀察結(jié)果,？滴/mL，1滴=？ul,√,×,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗操作要點,1、儀器：水平旋轉(zhuǎn)儀，轉(zhuǎn)速、轉(zhuǎn)幅,2、定性試驗

10、加樣：吸取0.05mL血清(漿)放在卡片圈中， 并均勻地涂布在整個圈內(nèi)加抗原：將抗原輕輕搖勻，用9號針頭加1滴抗原反應(yīng)：水平旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)8分鐘(23 ℃ -29 ℃） ，亮光下觀察結(jié)果,60滴/mL，1滴=17ul,100r/min約18mm,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗操作要點,3、定量試驗稀釋夜準(zhǔn)備：在反應(yīng)紙板圈內(nèi)加入50uL生理鹽水（根據(jù)需要確定圈數(shù)),勿將鹽水涂開加樣：吸取50uL血清（漿）與各圈中鹽水作系列

11、稀釋，并涂布整個圈內(nèi)。 下同定性試驗。,,,,,,,,,,,,,？,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:256,1:128,1:512,問題：定量試驗原倍血清滴度是多少？,問題：定量試驗血清稀釋需要使用試管嗎？,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗操作要點,3、定量試驗稀釋夜準(zhǔn)備：在反應(yīng)紙板圈內(nèi)加入50uL生理鹽水（根據(jù)需要確定圈數(shù)),勿將鹽水涂開加樣：吸取50uL血清（漿）與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布整個圈內(nèi)。

12、下同定性試驗。,,,,,,,,,,,,,1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:256,1:128,1:512,,非梅毒螺旋體抗原血清試驗臨床意義,非梅毒螺旋體抗原血清試驗方法簡單、快速、敏感性和特異性較好?？勺鳛槊范竞Y查試驗。因治療后血清滴度可下降并陰性，故（1）可作為療效觀察、判愈、復(fù)發(fā)或再感染的指征；（2）結(jié)梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗鑒別梅毒現(xiàn)癥感染和既往感染VDRL試驗用于神經(jīng)梅毒腦脊液檢測特異性高，

13、檢測陽性可以作為神經(jīng)梅毒確診依據(jù)，但敏感性較低，即檢測陰性不能排除神經(jīng)梅毒。,,血清固定早期梅毒（一期、二期）經(jīng)足量規(guī)則抗梅毒治療后 一期梅毒1年后轉(zhuǎn)為陰性 二期梅毒2年后轉(zhuǎn)為陰性。 晚期梅毒 治療后血清滴度下降緩慢，2年后約50%病人血清反應(yīng)仍為陽性。血清固定：一直保持低滴度，不轉(zhuǎn)陰,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗特點,,,,,,,,,,,,,1:1,1:2,1:8,1:4,1:16,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗特點,前帶現(xiàn)象,

14、,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗特點,假陽性反應(yīng)技術(shù)性假陽性反應(yīng)一般是由于操作錯誤引起的假陽性反應(yīng)，經(jīng)過重復(fù)試驗即可排除。生物學(xué)假陽性反應(yīng)(一般滴度小于1:8），應(yīng)采用梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗如TPPA等進行排除。,梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗原理,抗原為梅毒螺旋體特異蛋白（包括螺旋體重組特異抗原），檢測梅毒患者血中特異性抗梅毒螺旋體抗原的抗體。感染梅毒螺旋體后，一旦梅毒螺旋體抗體試驗呈陽性，則患者終身陽性。問題：梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試

15、驗的定量試驗在梅毒診療中有意義嗎？,梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗方法,梅毒螺旋體顆粒凝集試驗 (TPPA) 梅毒螺旋體血球凝集試驗 (TPHA) 梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA） 梅毒免疫層析法-梅毒快速檢測 (RT) 熒光螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS）梅毒螺旋體蛋白印跡試驗（WB）-IgM、IgG,TPPA,TPPA試驗用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒人血清中的抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)

16、生可見的凝集反應(yīng)，具有較高的敏感性和特異性。 TPPA是目前WHO公認(rèn)的梅毒抗原血清學(xué)試驗的“金標(biāo)準(zhǔn)”，常用于新方法、新試劑的參照標(biāo)準(zhǔn)。,,,+,,,,,,,,,,,,,,,,,,明膠顆粒,梅毒抗原,,,+,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,抗原致敏顆粒,抗原致敏顆粒,血液中抗體,抗原抗體凝集,TPPA試驗原理示意圖,29,,4+：

17、 粒子光滑覆蓋整個孔底，有時邊緣有折疊 3+： 粒子光滑覆蓋大部分底 2+：粒子光滑聚集覆蓋孔底，周圍有一細(xì)胞環(huán) 1+： 粒子光滑集聚覆概孔底，周圍有一明顯細(xì)胞環(huán) ±： 粒子沉集孔底，中央形成一小點 –： 粒子緊密沉積孔底中央,TPPA試驗結(jié)果判讀,a:均為RPR陽性標(biāo)本,ELI

18、SA/ CLIA,ELISA試驗是用重組梅毒螺旋體抗原包被固相板條，加上梅毒血清和單克隆抗體酶標(biāo)記物，形成抗原抗體復(fù)合物與酶標(biāo)記物結(jié)合，用酶聯(lián)檢測儀判定試驗陽性反應(yīng)。本法可用于大樣本血清檢測。化學(xué)發(fā)光法的臨床應(yīng)用意義基本同ELISA化學(xué)發(fā)光法的敏感性？？,梅毒免疫層析快速檢測方法（全血法）,31,梅毒免疫層析快速檢測方法（血清、血漿法）,梅毒螺旋體抗原血清試驗臨床意義,作為非梅毒螺旋體抗原血清試驗(如RPR等)初篩陽性標(biāo)本的確證試

19、驗，排除RPR 假陽性。不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，應(yīng)結(jié)合非梅毒螺旋體抗原血清試驗結(jié)果進行診斷。不能作為療效觀察的指標(biāo)。,梅毒血清學(xué)試驗結(jié)果解釋（梅毒臨床診斷參考依據(jù)）,34,問題：此結(jié)果解釋適用于先天（胎傳）梅毒嗎？,梅毒IgM抗體（TP-IgM）,IgM抗體的產(chǎn)生是感染后的早期體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。IgM分子比IgG較大，所以IgM抗體不能通過胎盤屏障。而母親的IgG抗體可以通過胎盤屏障傳給胎兒。因此若在新生兒血中檢測到IgG抗體不

20、能作為先天梅毒的診斷依據(jù)，而IgM抗體可為先天梅毒的診斷依據(jù)。 IgM抗體檢測其特異性較高，但敏感性較低。因此，IgM抗體檢測陰性，不能排除先天梅毒感染。,35,先天梅毒的診斷,先天梅毒的診斷標(biāo)準(zhǔn)梅毒暴露嬰兒具有以下條件之一：暗視野顯微鏡檢梅毒螺旋體陽性梅毒螺旋體IgM抗體陽性*RPR/TRUST檢測陽性，滴度比母親分娩前最近一次滴度高4倍及以上RPR/TRUST檢測隨訪中，任何一次滴度不下降或反而上升

21、滿18月齡后，TPPA檢測陽性,36,37,,梅毒實驗室檢測策略,,梅毒實驗室檢測策略思考,,,39,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗,梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗,,排除試驗假陽性確證梅毒螺旋體現(xiàn)癥感染,,排除治愈的既往感染者確證梅毒螺旋體現(xiàn)癥感染,？RPR：初篩試驗 TPPA：確證試驗,40,,,,41,陽性,42,,,43,陽性,梅毒篩查最佳策略,,,2015非梅毒螺旋體血清學(xué)試劑評估,45,46,2015梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試

22、劑評估,實驗室生物安全防護要求,一級生物安全防護水平：適用于第四類病原微生物二級生物安全防護水平：適用于第三類病原微生物三級生物安全防護水平：適用于第二類病原微生物四級生物安全防護水平：適用于第一類病原微生物,47,一般臨床血標(biāo)本處理是否需要在幾級生物安全實驗室操作?,梅毒實驗室安全生物暴露,a) 不慎發(fā)生標(biāo)本污染工作臺，不要立即用水沖洗，應(yīng)先用紙巾、布等敷料加上消毒液（如10%次氯酸鈉，75%乙醇等）消毒30分鐘以上，然后再清洗

23、。如污染工作服，應(yīng)立即脫下，高壓滅菌。b) 實驗時手部污染，應(yīng)立即用肥皂洗手并沖洗干凈，再外用消毒藥水，如誤入口內(nèi)，應(yīng)立即吐出，并用清水反復(fù)漱口，必要時根據(jù)實際情況用藥。c）被刺傷、劃傷等，應(yīng)先擠壓后沖洗，再擦以碘酒等簡單處理后，立即到醫(yī)院接受青霉素治療，同時應(yīng)做梅毒血清學(xué)檢測（？？）d) 出現(xiàn)與所檢測對象引起的疾病相似癥狀時，立即就醫(yī)。,48,梅毒控制規(guī)劃中期評估-梅毒實驗室檢測知識調(diào)查（1）,1.一旦感染梅毒，梅毒螺旋體特異

24、性抗體通常會終身陽性 2.RPR/TRUST只能用于梅毒初篩3. 二期梅毒時，TPPA和RPR兩種血清學(xué)試驗100％陽性4.接受抗梅治療的嬰兒，隨訪18個月后TPPA （+）/RPR（- ）可確診為胎傳梅毒 5.常規(guī)梅毒血清學(xué)檢測的是IgG抗體，不能檢測到IgM抗體6.TPPA（- ）/ RPR（+）結(jié)果一般可排除梅毒螺旋體感染 7. TPPA滴度檢測是臨床治療梅毒效果評價的重要參考指標(biāo),49,梅毒控制規(guī)劃中期評估-