狂犬病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

1、1,狂犬病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù),,2,一、實(shí)驗(yàn)室操作前的要求及準(zhǔn)備二、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法,,3,實(shí)驗(yàn)室操作前的要求及準(zhǔn)備,（一）實(shí)驗(yàn)室條件及生物安全操作要求（二）檢測(cè)標(biāo)本的要求（三）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備,4,（一）實(shí)驗(yàn)室條件及生物安全操作要求,1、暴露前免疫 工作人員需要暴露前免疫 意外暴露于狂犬病毒時(shí),必需立即報(bào)告部門(mén)負(fù)責(zé)人。2、P2實(shí)驗(yàn)室 操作所有潛在狂犬病感染的材料均應(yīng)在P2 或P3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行

2、 (實(shí)驗(yàn)室固定毒在P2，病人或動(dòng)物分離的街毒在P3）。3、P3實(shí)驗(yàn)室 對(duì)動(dòng)物標(biāo)本進(jìn)行狂犬病毒分離時(shí)，必須在P3 以上條件的專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。 沒(méi)有P3 實(shí)驗(yàn)室，嚴(yán)禁從事狂犬病毒分離工作。,5,4、個(gè)人防護(hù) 實(shí)驗(yàn)前要穿戴好防護(hù)服、眼鏡、手套， 作好技術(shù)上的準(zhǔn)備。5、防止氣溶膠擴(kuò)散 由于空氣傳播狂犬病毒已經(jīng)得到證實(shí)，因此高速混懸或離心操作應(yīng)在密閉狀態(tài)下進(jìn)行。

3、6、實(shí)驗(yàn)后消毒處理 實(shí)驗(yàn)后要作好善后消毒處理, 狂犬病毒對(duì)脂溶劑（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制劑和四銨化合物敏感，操作完畢對(duì)操作臺(tái)、實(shí)驗(yàn)材料等要用相應(yīng)的消毒劑或高壓蒸汽進(jìn)行消毒處理。,6,1、采集時(shí)間 （1）應(yīng)盡量采集較新鮮的標(biāo)本。 （2）采集時(shí)無(wú)菌操作，避免標(biāo)本污染2、標(biāo)本保存 （1）盡量低溫保存 （2）存放于無(wú)菌離心管中并進(jìn)行編號(hào)。 3、標(biāo)本類(lèi)型

4、 （1）唾液、腦脊液、眼角膜、咬傷處皮膚組織、腦組織、血清等。 （2）唾液、腦脊液、眼角膜、咬傷處皮膚組織、腦組織等均可用于 病原學(xué)檢測(cè)，其中以腦組織中的陽(yáng)性率最高； 血清和腦脊液可用于抗體的檢測(cè)。,（二）檢測(cè)標(biāo)本的要求,7,（三）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備,1、實(shí)驗(yàn)室及儀器的準(zhǔn)備（略）2、各種試劑及材料的準(zhǔn)備（略）,8,實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法,（一）DFA 法（二）巢式 PCR 法（三）其

5、它檢測(cè)方法（四）狂犬病診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS281-2008）中的檢測(cè)方法（五）美國(guó) CDC 狂犬病實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)中的檢測(cè)方法,9,（一）DFA 法（直接熒光抗體法） ——檢測(cè)狂犬病毒抗原,10,熒光抗體的染色方法可分為兩類(lèi)：直接法 — 熒光抗體直接與標(biāo)本內(nèi)的抗原反應(yīng), 優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)便、快捷、有效減少非特異性染色,

6、 只適用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的抗原；間接法 — 熒光抗體作為第二抗體，與直接結(jié)合胞內(nèi)抗原的第一抗體反應(yīng), 既可檢測(cè)胞內(nèi)抗原，也可以檢測(cè)體液中的特異抗體 相對(duì)直接法操作步驟增多 DFA原理： 抗體蛋白分子 + + 抗原→形成抗原抗體復(fù)合物→通過(guò)熒光顯微鏡→檢測(cè)抗原 熒光素,,11,操 作：,1、材料和儀器2、操作步驟

7、i. 印片： 用酒精浸泡載玻片 30 分鐘后取出、吹干， 分別取不同部位的腦組織剖面, 均勻的涂印在載玻片上； ii. 固定： 吹干后，取冷丙酮（4℃）室溫固定 7～10 分鐘； 取出吹干，進(jìn)行步驟3，或置于－ 70℃冰箱保存； iii. 加熒光抗體： 將稀釋好的熒光抗體滴加在固定好的抗原

8、片上 （如果從 冰箱中取出，則待霧氣散掉后再進(jìn)行此步驟。）；,12,iv. 孵育： 將抗原片放在濕盒中， 37℃溫育30 分鐘； v. 洗片： 取出后，用緩流沖洗抗原片 3～5 秒， 再用 PBS 振洗 2 遍， 蒸餾水振洗 1遍，每次 2 分鐘，吹干； vi. 封片鏡檢： 用 90％甘

9、油（ PBS）封片，加蓋玻片，熒光顯微鏡觀察。,攪拌器及染色缸,13,結(jié)果判斷：,仔細(xì)觀察每個(gè)視野的熒光強(qiáng)度，并結(jié)合不同視野的熒光分布，作出熒光強(qiáng)度的等級(jí)判斷：陰性、可疑、 ＋~ ＋＋＋＋－：無(wú)熒光；＋/－：極弱的可疑熒光；,無(wú)熒光“－”,14,＋：熒光較弱，但清晰可見(jiàn)；,15,＋＋：熒光明亮，且多個(gè)視野均有分布；,16,＋＋＋～＋＋＋＋：熒光閃亮，可見(jiàn)尼基氏小體清晰，且范圍廣泛；,熒光強(qiáng)度“＋＋＋”

10、 熒光強(qiáng)度“＋＋＋＋”,17,18,（二）巢式 PCR 方法——檢測(cè)狂犬病毒核酸,傳統(tǒng)的 PCR 檢測(cè)模式一般需要三個(gè)步驟：制備模板：對(duì)待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行核酸（DNA或 RNA）提取擴(kuò)增過(guò)程：采用 PCR 或 RT-PCR 技術(shù)對(duì)核酸進(jìn)行變性、退火、延伸擴(kuò)增；檢測(cè)過(guò)程：通過(guò)電泳等方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。 Sample Extract RNA or DNA

11、 PCR Electrophoresis photograph,19,巢式 PCR（nested－PCR）：,巢式 PCR的原理： 是設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其中一對(duì)引物在另一對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的片段上，通過(guò)二次 PCR 反應(yīng)對(duì)某個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)。通常第一次采用能擴(kuò)增較大片段的引物，經(jīng)過(guò)循環(huán)擴(kuò)增后，將第一次擴(kuò)增的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增。 優(yōu)點(diǎn)：

12、特異性、靈敏度均比常規(guī) PCR好。缺點(diǎn)： 比常規(guī) PCR易污染。,20,巢 式 PCR 方法的操作：,1、RNA 提?。篢rizol 法 （1）以下步驟在 P2 生物安全柜中進(jìn)行 取不同位置的少量腦組織（50-100mg）＋ 1000μ l Trizol 先加 200μ l（研磨均勻）然后加滿至 1000μ l [液體（唾液、尿液等）取 250μ l

13、＋ 750μ l Trizol LS] ↓ -70℃過(guò)夜或顛倒 Epp 管 30～40 次以便充分混勻內(nèi)容物， 室溫放置 5 分鐘

14、 （此步完可-70℃保存 1 個(gè)月）,21,（2） 以下步驟可在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行 -70℃取出，室溫融化→加 200μ l 氯仿， 快速顛倒 Epp 管數(shù)次（30 秒），使其呈淡粉紅色 ↓ 室溫放置 3min ↓ 4℃離心，12000rpm，15min （其間標(biāo)記新的離心管，每管中加 600μ l 異丙醇） ↓ 取離心后水相 600μ l，加入新的離心管中，輕柔混勻 ↓ 室溫放置 10 min （－20℃放置

15、30 分鐘效果更佳） ↓ 4℃離心，12000rpm，10min ↓,22,緩緩倒掉上清，用槍頭輕輕吸去殘存液體，可見(jiàn)少量沉淀 ↓ 加 1ml 75％乙醇（DEPC H2O 新鮮配制）洗滌沉淀 ↓ 4℃離心 12000rpm，10min ↓ 緩緩倒掉上清，用槍頭輕輕吸去殘存液體，室溫干燥數(shù)分鐘 （加入 75％乙醇至－70℃可長(zhǎng)期貯存 1～2 年） ↓ 腦組織的沉淀溶于 70ul DEPC H2O 中(2 個(gè) EP

16、P 管分裝) [液體（唾液、尿液等）的沉淀 溶于 35ul DEPC H2O 中] ↓ 直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄或－70℃貯存,23,注意事項(xiàng)： 1. 操作時(shí)一定戴口罩手套，保證離心管槍頭無(wú) RNA 酶 2. 一次提取核酸，樣本數(shù)不要太多（10 個(gè)左右） 3. 加入氯仿后到加入異丙醇之前的操作應(yīng)盡量快速且作用時(shí)間準(zhǔn)確， 否則容易降低提取效率 4. 異丙醇和乙醇作用時(shí)間略長(zhǎng)不影響結(jié)果 5. 加入

17、異丙醇后所有的混均操作要輕柔，加液體時(shí)貼壁緩流，以免破 壞到所提核酸 6. 盡量縮短 RNA 在空氣及室溫的暴露時(shí)間，水溶的 RNA 一定要低溫保存 7. 標(biāo)本及時(shí)放回-20℃或-70℃,24,2、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA1）pd(N)6 稀釋至 0.2ug/ul2）水浴預(yù)熱至 65℃（其間標(biāo)記反應(yīng)管） 3）33ulRNA 液 65℃水浴 10min（其間準(zhǔn)備冰盒或碎冰）4）冰浴 2min，瞬時(shí)離

18、心。5）將液體轉(zhuǎn)移至試劑盒反應(yīng)管中 32ul，先不要混勻。6）再向反應(yīng)管中加入 1ul pd(N)6 0.2ug/ul 或特異引物各 0.5ul，使總體 積達(dá)到 33ul，室溫 1min，混勻，瞬時(shí)離心。 7）37℃水浴，60min 8） -20℃或-70℃保存 cDNA,25,3、巢 式 PCR：,26,27,瓊脂糖凝膠電泳 1．電泳槽中注入緩沖液 TAE 2．將做好的瓊脂膠放入電泳槽（加樣孔在負(fù)

19、極方向） 3．Marker 加 5 ul，樣品加 10ul5．電壓：100V6．時(shí)間：30min 照相：凝膠成像儀/紫外透射儀,28,（三） 其它檢測(cè)方法,1、ELISA——檢測(cè)抗原：包被抗體：用pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液稀釋的抗狂犬病毒核衣殼IgG 包被96 孔酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜； 封閉：用含0.3％牛血清白蛋白和5% 蔗糖的pH9.6 碳酸鹽緩沖液封閉30分鐘；

20、 加待檢標(biāo)本：將采集到的標(biāo)本研磨，用pH 7.4 PBS制成30％的懸液，離心取上清加 入酶標(biāo)板孔內(nèi)，同時(shí)設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照，200 μ l/孔，37℃孵育1 小時(shí)； 洗板：洗板四次；加酶標(biāo)抗體：后加入純化的酶標(biāo)記抗狂犬病毒抗體200μl/孔，37℃ l 小時(shí)；洗板：同上；加底物：加入酶反應(yīng)底物，室溫作用30 分鐘；終止反應(yīng)：加

21、2M H2SO4 終止反應(yīng)；觀察結(jié)果：肉眼觀察或酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果。,29,2、熒光灶抑制試驗(yàn)——檢測(cè)中和抗體,中和抗體： 為疫苗免疫力程度的評(píng)判指標(biāo) 中和抗體水平等于或高于0.5IU/ml 血清，表示能得到有效的保護(hù)快速熒光灶抑制試驗(yàn)（RFFIT）： 為WHO 推薦的檢測(cè)方法 制備細(xì)胞懸液( 1×10 cells/ml 的 BSR 細(xì)胞懸液)

22、 ↓ 稀釋血清和病毒(待測(cè)血清、對(duì)照血清、標(biāo)準(zhǔn)血清、病毒固定毒CVS 株） ↓ 中和血清和病毒( 0.1ml血清 和標(biāo)準(zhǔn)病毒稀釋液0.1 m1 ，37℃中和1.5 小時(shí)) ↓ 檢測(cè)剩余病

23、毒(每孔加入 50 µl 制備好的細(xì)胞懸液，37℃、5% C02 過(guò)夜培養(yǎng)) ↓ 固定(棄掉培養(yǎng)液，PBS 洗一次，丙酮固定) ↓ 熒光抗體檢測(cè)(干燥后，加熒光素標(biāo)記的抗狂犬病毒抗體，37℃ 30 分鐘)

24、 ↓ 觀察結(jié)果( PBS 洗3 次，熒光顯微鏡觀察結(jié)果) ↓ 計(jì)算中和抗體滴度(實(shí)驗(yàn)組中能使熒光灶抑制≥50％的血清最高稀釋倍數(shù)，即為被檢血清的中和抗體滴度),步驟,,30,3、病毒分離,A. 細(xì)胞培養(yǎng)法——分離病毒研磨標(biāo)本 → 制成

25、懸液（用PBS 或MEM ，30％ ）→ 離心（ 4℃ 2000r/min 離心20 m） → 取上清接種細(xì)胞（鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞、Vero 細(xì)胞或BHK21 細(xì)胞） → 吸附（ 2 h） → 加維持液 → 孵育(37℃ 、5％C02 、4～5 天) → 鑒定B. 乳小白鼠接種法——分離病毒研磨標(biāo)本 → 制成懸液 → 離心 → 取上清接種乳鼠腦內(nèi)（ 1～2 日齡） → 飼養(yǎng) → 觀察發(fā)病情況(未發(fā)病的鼠保留至21 天后作DFA檢測(cè)),3

26、1,4、ELISA——檢測(cè)狂犬病毒抗體ELISA方法測(cè)定的是總抗體，不代表具有保護(hù)性的中和抗體水平其結(jié)果僅供參考。5、染色鏡檢——檢測(cè)內(nèi)基氏小體,32,（四）狂犬病診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS281-2008）中的檢測(cè)方法,1、DFA法——檢測(cè)狂犬病毒抗原 意義： 陽(yáng)性結(jié)果，表明有狂犬病毒感染，有確診意義。2、ELISA——檢測(cè)狂犬病毒抗原 意義： 檢測(cè)到狂犬病毒抗原陽(yáng)

27、性有診斷意義。3、細(xì)胞培養(yǎng)方法——分離狂犬病毒 意義： 陽(yáng)性結(jié)果表明有狂犬病毒感染，有確診意義。,33,4、RT-PCR——檢測(cè)狂犬病毒核酸,原理： 狂犬病毒為負(fù)鏈RNA病毒，PCR前需要經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶作用，合成一條cDNA鏈（RT）,再進(jìn)行PCR。檢測(cè)步驟： 1）病毒RNA的提取 2）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

28、 3）PCR擴(kuò)增 4）電泳意義： 陽(yáng)性結(jié)果表明有狂犬病毒感染，有確診意義。,34,5、狂犬病特異性抗體檢測(cè),狂犬病特異性抗體： 在自然感染情況下，狂犬病毒→通過(guò)帶有病毒的動(dòng)物唾液→進(jìn)入機(jī)體傷口→在入侵部位基本上不增殖（一般也不侵入血流） →故不能形成病毒血癥。 在感染后，狂犬病毒或其抗原→不能與機(jī)體免疫系統(tǒng)廣泛接觸→故機(jī)體無(wú)

29、免疫應(yīng)答反應(yīng)（針對(duì)狂犬病毒）。 晚期，狂犬病→破壞血腦屏障→ 大量病毒抗原→進(jìn)入血流→刺激機(jī)體→產(chǎn)生大量特異性抗體。 因此，通常在發(fā)病早期血清中查不到抗體或抗體滴度很低，只在臨床疾病的晚期出現(xiàn)。,35,A. 快速熒光灶抑制試驗(yàn)（RFFIT）—— 測(cè)定中和抗體意義： 中和抗體水平等于或高于0.5IU/ml 血清，表示能得到有效的保護(hù)B. ELISA—— 檢測(cè)狂犬病毒抗體意義：

30、 1）接種過(guò)狂犬病疫苗的患者抗體滴度大于0.5IU/ml ，表明已獲得一定的保護(hù)。 2）未接種過(guò)疫苗的患者的抗體滴度大于1IU/ml ，且近期有4倍增高，可考慮狂犬病。 3）部分狂犬病患者在臨死前抗體滴度也可能異常增高。,36,（五）美國(guó) CDC 狂犬病實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)中的檢測(cè)方法,1、DFA ——檢測(cè)狂犬病毒抗原 當(dāng) 以下情況發(fā)生時(shí)，需要重復(fù)（證實(shí)性）檢測(cè): 1）包涵體顆粒典型，但視野不到 10％，或

31、視野大于 10％，但抗原分布極 度稀疏（如每個(gè)視野中只有 1 到 2 個(gè)包涵體顆粒）； 2）包涵體顆粒典型，但染色強(qiáng)度較弱且缺乏特征性； 3） 包涵體顆粒不典型，但染色強(qiáng)度好 （如結(jié)構(gòu)大小均勻、形態(tài)規(guī)則）； 4） 非特異性熒光顆粒掩蓋了少量狂犬病毒顆粒的特異性染色； 5） 兩種試劑的檢測(cè)結(jié)果或兩個(gè)技術(shù)人員的結(jié)果判定不一致。當(dāng)進(jìn)行重復(fù)性確證性DFA

32、檢測(cè)時(shí)，通常采用兩種以上的檢測(cè)試劑進(jìn)行同比實(shí)驗(yàn)。,37,2、 RT-PCR——檢測(cè)核酸3、細(xì)胞培養(yǎng)法——分離病毒：鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞（MNA） 目 的： 從未知的腦懸液中分離狂犬病毒， 作為 DFA 檢測(cè)之外的另一種確證性檢測(cè)結(jié)果解釋?zhuān)??分離到狂犬病毒，結(jié)果為陽(yáng)性。 ?傳代 2 次后分離不到狂犬病毒，結(jié)果為陰性。 注 ：如果檢測(cè)