根癌農桿菌GW4中酶促和H2O2介導的非酶促銻氧化機制.pdf

1、銻(Antimony, Sb)是劇毒類金屬，與同主族的砷(Arsenic，As)有很多相似的理化性質。由于銻的廣泛應用、銻礦的開采以及銻化物的大量生產使銻污染問題日益嚴峻，嚴重危害人類健康。銻氧化型細菌可將毒性強的三價銻類物質[Antimonite，Sb(Ⅲ)]氧化為毒性弱的五價銻[Antimonate，Sb(Ⅴ)]類，降低銻對細菌和環(huán)境的毒性。因此，研究細菌中的銻代謝、鑒定新型銻氧化酶、闡明銻氧化機制對環(huán)境銻循環(huán)和銻污染治理均具有重要

2、意義。近年來國際國內學者對銻轉化的研究日漸重視，但在本人碩士研究開始之前(2012年)，微生物Sb(Ⅲ)氧化的分子機制仍是空白。本研究團隊近年來發(fā)現(xiàn)了多種異養(yǎng)型銻氧化細菌，本論文以異養(yǎng)型砷/銻氧化菌Agrobacteriumtumefaciens GW4為材料，研究了銻氧化及能量代謝機制，主要研究內容和結果如下:
　　1.首次發(fā)現(xiàn)了以NADP+為輔酶的Sb(Ⅲ)氧化酶AnoA。通過前期蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)氧化還原酶AnoA在Sb(Ⅲ

3、)條件下表達量上調;熒光定量和報告基因融合的方法證實anoA基因的轉錄受不同濃度Sb(Ⅲ)的誘導;基因的同框缺失敲除、互補及超表達實驗證明anoA與菌株的Sb(Ⅲ)表型密切相關;缺失anoA基因使Sb(Ⅲ)氧化速率（下降～27％）及抗性下降，互補株表型回復，超表達anoA使Sb(Ⅲ)氧化速率升高～34％;表達純化AnoA蛋白進行體外酶反應動力學實驗，結果表明AnoA能夠在體外以NADP+為輔酶直接催化Sb(Ⅲ)的氧化，Km為64±10μ

4、M，Vmax為150±7nmolmin-1 mg-1;此外，由于砷、銻結構的相似性，AnoA還能夠在體外催化As(Ⅲ)的氧化，但AnoA與底物As(Ⅲ)的親和力以及酶反應速率均不如Sb(Ⅲ);在E.coli中異源表達AnoA能夠顯著提高菌株Sb(Ⅲ)的氧化速率。以上結果表明AnoA為細菌體內新型Sb(Ⅲ)氧化酶，但細菌中仍然存在著其它氧化Sb(Ⅲ)的因子。
　　2.闡明了細胞內產生的H2O2能夠作為非酶促因子氧化Sb(Ⅲ)至Sb(

5、Ⅴ)。Sb(Ⅲ)能夠誘導細胞產生氧化壓力從而產生大量H2O2;能夠將H2O2分解為H2O和O2的過氧化氫酶基因katA受不同濃度Sb(Ⅲ)和H2O2的誘導且在菌株對Sb(Ⅲ)和H2O2的抗性中起重要作用;敲除katA基因后，菌株GW4-ΔkatA的氧化速率顯著加快，且細胞內H2O2含量顯著增加，互補株表型回復;在細菌體內，隨著細胞的生長，H2O2含量逐漸下降，而Sb(Ⅲ)氧化生成的Sb(Ⅴ)含量逐漸升高(R2=0.93，P＜0.05)，

6、說明細菌體內逐漸減少的H2O2用于氧化Sb(Ⅲ);在培養(yǎng)基中，Sb(Ⅲ)過量的條件下，添加的H2O2濃度越高，Sb(Ⅲ)氧化生成的Sb(Ⅴ)含量越多，呈正相關(R2=0.94，P＜0.05)。以上結果表明Sb(Ⅲ)誘導產生的氧化壓力與菌株對Sb(Ⅲ)氧化及抗性密切相關，胞內H2O2作為非酶促因子氧化Sb(Ⅲ)能夠同時降低Sb(Ⅲ)和氧化壓力對細胞的毒害，是細菌中一種重要的“以毒攻毒”的機制。
　　3.鑒定了砷氧化酶AioAB在菌株

7、GW4的Sb(Ⅲ)氧化過程中的作用。砷氧化酶AioAB能夠在細胞周質氧化As(Ⅲ)為As(Ⅴ)。前期研究表明AioAB在A.tumefaciens5A中也能夠催化Sb(Ⅲ)的氧化，aioA基因的缺失使菌株5A的Sb(Ⅲ)氧化速率下降。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在A.tumefaciens GW4中敲除aioA基因后菌株GW4的氧化速率加快;熒光定量PCR結果表明這是由于aioA基因的缺失能使銻氧化酶基因anoA和過氧化氫酶基因katA上調表達;

8、此外，加銻條件下突變株GW4-ΔaioA細胞內H2O2含量也比野生型明顯增加，互補株的表型回復，說明缺失aioA后細胞內AnoA催化的酶促和H2O2介導的Sb(Ⅲ)氧化均會上調。以上結果表明AioAB在菌株GW4中作用并不顯著，但通過影響AnoA和KatA的表達來參與銻氧化。
　　4.闡明了菌株GW4中Sb(Ⅲ)和砷氧化酶AioAB對銻響應代謝途徑和能量產生的影響。通過前期蛋白質組學研究結合基因的轉錄和代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)Sb(Ⅲ)

9、能夠誘導菌株GW4和突變株GW4-ΔaioA中Sb(Ⅲ)氧化和抗性、壓力響應、碳代謝、細胞運動性、磷酸鹽和磷酸酯代謝、核苷酸和氨基酸代謝等相關蛋白/基因的表達;且在加Sb(Ⅲ)條件下，菌株GW4-ΔaioA中這些代謝路徑蛋白/基因上調更顯著。因此我們認為這是由于細胞周質Sb(Ⅲ)氧化消失后，Sb(Ⅲ)對細胞造成了更多的毒害作用，因此細胞質中AnoA和氧化壓力相關的蛋白均上調，加快細胞內Sb(Ⅲ)的氧化;同時，TCA循環(huán)上調從而產生更多的

10、能量供菌株生長并抵御Sb(Ⅲ)的毒性;Sb(Ⅲ)氧化過程中產生的能量用于Sb轉運、DNA損傷修復、蛋白質的合成、細胞運動等。
　　綜上，本論文通過對異養(yǎng)型Sb(Ⅲ)氧化菌GW4的系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)了新型銻氧化酶，首次提出了細菌的Sb(Ⅲ)氧化是一個由酶促反應(AnoA，AioAB)和非酶促反應(H2O2)共同組成的共代謝過程。此外，還闡明了砷氧化酶AioAB對Sb(Ⅲ)壓力響應代謝路徑和能量產生的影響，解析了菌株GW4在加Sb(Ⅲ)條