根癌農(nóng)桿菌GW4中磷酸鹽調(diào)控蛋白PHOB介導(dǎo)的銻氧化調(diào)控機(jī)制.pdf

1、銻(Antimony)是一種劇毒的類金屬，銻中毒會導(dǎo)致人體心肌衰竭、肝壞死等疾病。自然界中有些微生物能夠通過氧化毒性強(qiáng)的Sb(Ⅲ)至毒性弱的Sb(Ⅴ)來解毒。本課題組前期發(fā)現(xiàn)在銻氧化型細(xì)菌Agrobacterium tumefaciens GW4中Sb(Ⅲ)的氧化是銻氧化酶AnoA催化的酶促和H2O2介導(dǎo)的非酶促銻氧化共同組成的，但對于AnoA表達(dá)的調(diào)控機(jī)制還尚未闡明并且目前微生物Sb(Ⅲ)壓力下的響應(yīng)機(jī)制也尚未報道。本論文開展了菌株G

2、W4在不加銻與加50μM Sb(Ⅲ)條件下的比較蛋白質(zhì)組研究，然后利用分子生物學(xué)技術(shù)研究銻氧化酶AnoA的調(diào)控機(jī)制，并分析了銻壓力下的代謝路徑。
　　通過蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜測序鑒定得到21個加銻差異表達(dá)蛋白質(zhì)均上調(diào)表達(dá)，根據(jù)KEGG功能分類，分別屬于銻氧化及外排、碳代謝、脂類代謝、氨基酸代謝及膦酸酯代謝和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)等。其中，我們發(fā)現(xiàn)在加銻條件下磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PstS2的上調(diào)表達(dá)，前期報道PstS蛋白受磷酸鹽調(diào)控蛋白PhoB的調(diào)控。P

3、hoB為全局性調(diào)控蛋白，我們推測磷酸鹽調(diào)控系統(tǒng)可能與Sb(Ⅲ)氧化存在相關(guān)性。
　　基因組分析發(fā)現(xiàn)菌種GW4有兩套磷酸鹽調(diào)控系統(tǒng)。將位于砷基因島上一套命名為1，該基因簇中的磷酸鹽調(diào)控蛋白基因phoB1位于磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)pstBACS1的下游，方向相反;將遠(yuǎn)離砷基因島的另一套命名為2，該基因簇中的磷酸鹽調(diào)控蛋白基因phoB2位于磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)pstBACS2的下游，方向相同。本論文主要結(jié)果如下:(1)通過報告基因融合實驗，我們檢測到

4、GW4中的磷酸鹽調(diào)控蛋白基因phoB1受Sb(Ⅲ)誘導(dǎo)效果不明顯，但phoB2能夠受Sb(Ⅲ)顯著誘導(dǎo);(2)在加Sb(Ⅲ)條件下檢測菌株GW4、GW4-△phoB1、GW4-△phoB2、GW4-△phoB1/phoB2中銻氧化酶基因anoA的酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較野生型GW4中anoA的酶活相比，缺失phoB2基因anoA的酶活性受到明顯的抑制，phoB1基因的缺失使anoA的酶活性略有下降，而雙敲除株GW4-△pho B1/phoB2中

5、anoA酶活幾乎喪失;(3)對各個菌株進(jìn)行生長和銻氧化實驗結(jié)果表明，單敲除株在50μM Sb(Ⅲ)濃度下生長、銻氧化均不受影響，GW4-△phoB1/phoB2雙敲菌株在不影響生長的情況下銻氧化效率明顯降低;(4)對各個菌株在加Sb(Ⅲ)條件進(jìn)行胞內(nèi)H2O2含量測定，結(jié)果顯示GW4-△phoB1中H2O2含量較GW4顯著升高，GW4-△phoB2中H2O2含量極顯著升高，互補(bǔ)株均回復(fù)表型。這些結(jié)果表明單敲除株氧化速率沒有降低很可能是由于

6、H2O2發(fā)揮了Sb(Ⅲ)氧化作用;而雙敲除株中H2O2含量雖比野生型高，但仍低于GW4-△phoB2，并不足以彌補(bǔ)anoA的作用，因此氧化速率減慢;(5)細(xì)菌單雜交和EMSA等方法證明PhoB1、PhoB2能夠與anoA啟動子區(qū)DNA在體內(nèi)和體外相互作用，并確定了結(jié)合位點。以上結(jié)果表明，磷酸鹽調(diào)控蛋白PhoB1與PhoB2均對銻氧化酶基因anoA有一定的調(diào)控作用，但是PhoB2的調(diào)控作用更強(qiáng)。
　　該研究闡明了菌株GW4中銻氧化酶