酶免基礎(chǔ)知識和血篩產(chǎn)品介紹

1、酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)簡介血液篩查試劑特點及發(fā)展歷程,北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司汪 月 才 2012年3月,一、酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)簡介,什么是ELISA?,免疫測定（immunoassay，IA）是應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)測定標(biāo)本的方法。在臨床檢驗中主要通過抗原抗體反應(yīng)檢測體液中的抗體或抗原性物質(zhì) 。 ELISA是一種免疫測定。,基礎(chǔ)定義,抗原（Antigen）：能在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？贵w（Antibody）：能與抗原特異性結(jié)

2、合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。機(jī)體被微生物感染后，先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過一段時間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長期存在，在疾病痊愈后可持續(xù)數(shù)年之久。,重要指標(biāo),靈敏度：能檢測到的分析物的最小量，表示檢測下限的能力。特異性：鑒別陰性標(biāo)本的能力。精密度：指對同一個標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)分

3、析，其結(jié)果間的符合率。,重要指標(biāo),穩(wěn)定性：指在效期內(nèi)試劑質(zhì)量參數(shù)的變化。一般用非儲存條件下較高溫度進(jìn)行破壞性實驗數(shù)天，參觀各質(zhì)量參數(shù)的變化，一般37℃ 1天相當(dāng)于4℃45天,還有2-8℃長期穩(wěn)定性。質(zhì)控血清：指為了對實驗結(jié)果進(jìn)行控制而配制的血清。一般用無溶血無脂血的血清或血漿。本底：指底色，如HBsAg ELISA試劑盒，陽性顯色、陰性不顯色，本底就是陰性顯色的情況；,ELISA檢測方法,1.夾心法. 2.

4、間接法. 3.競爭法. 4.捕獲法.,夾心法,雙抗原夾心：固相(包被)抗原Ag + 樣品(抗體Ab) + 酶標(biāo)抗原Ag* → Ag-Ab-Ag* + 底物(TMB)→顯色雙抗體夾心：固相(包被)抗體Ab + 樣品(抗原Ag) + 酶標(biāo)抗體Ab * → Ab-Ag-Ab* + 底物(TMB)→顯色,間接法,固相(包被)抗原Ag + 樣品(抗體Ab) + 酶標(biāo)二抗Ab* → Ag-Ab

5、-抗Ab* + 底物(TMB)→顯色,競爭法,固相(包被)抗原Ag + 樣品(無抗體Ab) + 酶標(biāo)抗體Ab* → Ag-Ab* + 底物(TMB)→顯色,捕獲法,固相-抗IgM抗體(抗µ) + 樣品(IgM) →抗µ-IgM + 酶標(biāo)抗原Ag* →抗µ-IgM-Ag* + 底物(TMB)→顯色,與其他檢測方法比較,二、血液篩查試劑特點及發(fā)展歷程,1、人類免疫缺陷病毒診斷試劑,,HIV ELSIA試劑的

6、發(fā)展,第三代檢測試劑簡介,全稱：人類免疫缺陷病毒HIV（1+2型）抗體診斷試劑盒方法：雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法（第三代）檢測對象：血液標(biāo)本中的HIV總抗體原料：基因重組（萬泰和廈大合作研制），包被GP41、GP120、GP36，片段齊全。檢測窗口期：20天左右,基 因 重 組 多 表 位 嵌 合 抗 原,對HIV-2型陽性出色的檢測能力,試劑盒內(nèi)設(shè)置有HIV Ⅰ型和Ⅱ型陽性對 照，為國產(chǎn)試劑首創(chuàng)，我們使用美國BBI 血清

7、盤Panel202對萬泰試劑進(jìn)行考核。,,對HIV O亞型的檢測,O亞型血來源于美國BBI,超強(qiáng)的抗干擾能力,臨床研究顯示，多種其他疾病潛在干擾因素血清標(biāo)本均不會影響萬泰兩步法HIV診斷試劑盒的靈敏度和特異性，適合臨床使用,23,第四代診斷試劑簡介,,HIV-Ab與HIV-Ag雙系統(tǒng)檢測 ——HIV-Ag和HIV P24抗體共同包被 ——雙抗原夾心法檢測HIV-Ab ——雙抗體夾心法檢測

8、HIV-Ag生物素-親和素反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)用 ——包被抗體＋生物素標(biāo)記抗體＋HRP標(biāo)記親和素,國產(chǎn)第四代HIV診斷產(chǎn)品明顯縮短窗口期,,25,結(jié) 論 HIV Ag/Ab診斷試劑,全新第四代 HIV 篩查試劑為使用者提供 :,增強(qiáng)檢驗安全性,更可信賴的實驗結(jié)果,,2、乙肝系列診斷試劑,簡 介,1、乙型肝炎HBsAg及HBsAb檢測2、乙型肝炎HBeAg及HBeAb檢測3、乙型肝炎HBcAb及HBc

9、Ab-IgM檢測4、乙型肝炎前-S1及前-S2檢測（大蛋白）5、乙型肝炎HBcAg及前-S1檢測（ Dane顆粒）6、乙型肝炎核酸檢測,乙肝標(biāo)志物及臨床意義1,乙型肝炎病毒（HBV）具有明顯的種屬及嗜肝特性，可致持續(xù)性病毒感染。我國屬乙肝感染的高發(fā)區(qū)，乙肝表面抗原（HBsAg）的攜帶者超過10%。通常判斷HBV感染及其狀況的指標(biāo)為HBV血清血標(biāo)志物—乙肝兩對半、HBc-IgM、HBV DNA等。乙肝病毒（HBV）又稱Dane顆

10、粒（丹顆粒），由外至內(nèi)可分為包膜蛋白、核殼蛋白、HBV DNA等主要組成。包膜蛋白構(gòu)成乙肝病毒表面抗原（HBsAg）核殼蛋白構(gòu)成乙肝病毒核心抗原（HBcAg）和乙肝病毒e抗原（HBeAg）,乙肝標(biāo)志物及臨床意義2,乙肝表面抗原（HBsAg） HBsAg于1963年在澳大利亞土著人血中發(fā)現(xiàn)，故也稱為澳大利亞抗原（簡稱“澳抗”），具有免疫原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，是機(jī)體感染HBV后最早出現(xiàn)的血清血指標(biāo)。 HBsA

11、g分為4個亞型：adr、adw、ayw和ayr。不同亞型的HBsAg刺激機(jī)體產(chǎn)生的HBsAb不同。,乙肝標(biāo)志物及臨床意義3,乙肝表面抗體（HBsAb） HBsAg刺激機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體，能中和體液中的HBV，感染乙肝病毒后6-23周出現(xiàn)。見于乙肝恢復(fù)期、HBV既往感染和乙肝疫苗免疫后。HBsAb滴度≥10mIU表示具有保護(hù)性，可抵御同一亞型的再感染。,乙肝標(biāo)志物及臨床意義4,乙肝病毒核心抗原（HBcAg） HBV核

12、心顆粒外表面具有HBcAg活性，但外周血中沒有游離的HBcAg。HBcAg陽性表示有Dane顆粒存在，有傳染性。,乙肝標(biāo)志物及臨床意義5,乙肝核心抗體（HBcAb） HBcAb是乙肝核心抗原的總抗體。感染HBV后最早出現(xiàn)的抗體是HBc-IgM抗體，它是乙肝病毒急性感染的重要指標(biāo)，慢性肝炎的炎癥活動期也呈陽性。核心抗體不是中和抗體，HBc-IgG抗體可持續(xù)多年不消退，是既往感染的指標(biāo)。,乙肝標(biāo)志物及臨床意義6,乙肝e抗原（HBe

13、Ag） HBV核心顆粒內(nèi)表面具有HBeAg活性，也可以由HBcAg經(jīng)蛋白酶降解后產(chǎn)生，在乙肝潛伏期后期出現(xiàn)，略晚于HBsAg。HBeAg陽性表示HBV在體內(nèi)復(fù)制，有很強(qiáng)的傳染性。 進(jìn)入恢復(fù)期后，HBeAg隨著HBsAg的消失而消失，其消失前后出現(xiàn)HBeAb。,乙肝標(biāo)志物及臨床意義7,乙肝e抗體（HBeAb） HBeAb的出現(xiàn)預(yù)示HBV復(fù)制減弱或中止，疾病可能向好的方向轉(zhuǎn)化。HBeAg逐漸消失HBeAb逐漸產(chǎn)

14、生的時期稱為血清轉(zhuǎn)換期，即由復(fù)制期轉(zhuǎn)為非復(fù)制期。在這一時期可能出現(xiàn)eAg、eAb同陽的現(xiàn)象。HBeAb也不是保護(hù)性抗體。,乙肝標(biāo)志物產(chǎn)生的先后順序,HBsAg→(HBcAg)→HBcAb→HBeAg→HBeAb,乙肝兩對半模式,常見模式（出現(xiàn)率1～40%）,常見模式（出現(xiàn)率1～40%）,少見模式（出現(xiàn)率1～4%）,少見模式（出現(xiàn)率1～4%）,少見模式（出現(xiàn)率1～4%）,3、丙型肝炎診斷試劑,抗-HCV檢測中HCV的抗原,簡介,全稱：丙型

15、肝炎病毒抗體診斷試劑盒方法：間接酶聯(lián)免疫法（第三代）檢測對象：血液標(biāo)本中的HCV IgG 抗體原料：基因重組，包被NS3、NS4、NS5、CORE，片段齊全。,窗口期,檢測針對HCV四種抗原的抗體第二代試劑在感染后平均10周左右可以檢出第三代試劑感染后平均7-8周為陽性在極少數(shù)病例中，如免疫抑制、腎功能衰竭等，抗-HCV可以保持陰性,檢定所考評市場流通的HCV抗體檢測試劑,,發(fā)展方向,1、雙抗原夾心法代表生產(chǎn)企業(yè)：北京

16、萬泰目前進(jìn)度：完成臨床考核，等待批準(zhǔn)文號2、抗原抗體聯(lián)合檢測方法代表生產(chǎn)企業(yè)：美國伯樂目前進(jìn)度：2009年在歐洲上市，2012年下半年引入中國,4、TP,簡 介,全稱：梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒方法：雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法檢測對象：血液標(biāo)本中的梅毒總抗體原料：基因重組原料包被P15、P17、P47。,常用梅毒檢測方法的比較,TP EIA 與TPPA的比較,標(biāo)本：類風(fēng)濕病人血清10份，乙肝病人血清20份，紅斑狼瘡病人血清

17、6份。來源于解放軍301醫(yī)院。,結(jié)論：在被檢測的36份血清中，未發(fā)現(xiàn)假陽性反應(yīng)。,萬泰TP試劑對特殊標(biāo)本的檢測,,檢測單位：北醫(yī)第一醫(yī)院皮膚科、新疆HIV檢測中心,結(jié)論：萬泰梅毒EIA靈敏度較TPPA好,部分臨床考核數(shù)據(jù),6、膠體金系列,試紙條的結(jié)構(gòu)及制造工藝,WT,,,,,,,,,,,1,2,3,4,5,6,7,8,8,1. 塑料底襯2. 黏合劑3. 硝酸纖維素膜4. 對照線5. 檢測線6. 交聯(lián)墊（樣品墊）7

18、. 吸水紙8. 保護(hù)膜,,,,,,試紙條圖解,試紙條工作原理,在硝酸纖維素膜的檢測線上包被有特異性抗體，對照線上包被有兔抗抗體，另一個特異性抗體在標(biāo)記膠體金后干燥于硝酸纖維素膜下端的玻璃纖維上。 當(dāng)樣品由于層析原理流動時，首先溶解干燥的金標(biāo)sAb單抗，特異性HBsAg抗原與其反應(yīng)，在流過檢測線時再和另一個單抗結(jié)合形成免疫復(fù)合物。由于包被單抗被固定在硝酸纖維素膜上，免疫復(fù)合物就被留下，逐漸形成肉眼可見的紅紫色條帶，此

19、時該樣品為陽性。繼續(xù)流動到對照線時，金標(biāo)sAb單抗和羊抗兔IgG結(jié)合顯色，出現(xiàn)對照帶。 當(dāng)樣品中不含HBsAg特異性抗原時，標(biāo)記膠體金的單抗流過對照線時也可和該處的羊抗兔抗體結(jié)合也可形成紅紫色條帶，導(dǎo)致對照線顯色。,WT,膠體金試紙條的優(yōu)缺點： （1）優(yōu)點:(a)靈敏度適中； (b)使用方便，適于快速診斷；

20、 (c)易于存放，效期長。 （2）缺點:(a) 應(yīng)用時間短，范圍小； (b)部分項目靈敏度較低； (c) 價格較貴。,三、新版藥典對血篩試劑改進(jìn)及意義,2010版《中國藥典》新要求,2010版《中國藥典》于2010年10月1號起正式執(zhí)行其對血

21、篩四項診斷試劑（HIV/HBsAg/HCV/ TP）的新要求：試劑反應(yīng)時間均不低于60分（加樣后）、30分（加酶后）、30分（顯色）優(yōu)化后的診斷試劑，在保證特異性不變的情況下，靈敏度均有不同程度的提高,新/舊反應(yīng)模式重點操作參數(shù)對比,在血篩試劑方面的不同之處及意義,優(yōu)勢：1、靈敏度明顯提高，提升血液安全級別；2、特異性顯著提高；3、影響因素減少，變異系數(shù)提高；劣勢：1、工作時間延長；2、實驗過程要求提高。,61,,謝謝！