秸稈降解菌黃綠木霉木聚糖酶基因的克隆及高效表達(dá).pdf

1、木聚糖是半纖維素的主要成分，而半纖維素又是自然界中除了纖維素之外的第二大豐富的資源。木聚糖酶能夠降解自然界中大量存在的木聚糖，在造紙、食品、紡織、飼料、能源工業(yè)等方面具有重要的應(yīng)用前景及商業(yè)價(jià)值，而且不同來(lái)源的木聚糖酶其降解特性不同，因此，有必要對(duì)不同來(lái)源的木聚糖酶進(jìn)行系統(tǒng)的研究。
　　本研究應(yīng)用基因工程手段以黃綠木霉為材料克隆未知木聚糖酶基因，構(gòu)建高產(chǎn)木聚糖酶的工程菌，并對(duì)該木聚糖酶的理化性質(zhì)、酶學(xué)特性、動(dòng)力學(xué)常數(shù)等參數(shù)進(jìn)行研究

2、。本實(shí)驗(yàn)的主要研究結(jié)果如下:
　　1.根據(jù)GenBank上的綠色木霉、里氏木霉和棘孢木霉木聚糖酶基因兩端的保守序列信息，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)出黃綠木霉木聚糖酶基因克隆引物p1、p2，成功的克隆出一條未知的黃綠木霉木聚糖酶基因的編碼序列，并提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，命名為T(mén)AX1基因，登錄號(hào)為KM076643，填補(bǔ)了國(guó)際空白。
　　2.利用RT-PCR方法，成功的克隆出黃綠木霉木聚糖酶基因的cDNA序列，通過(guò)cDNA序

3、列與DNA序列的比對(duì)，確定了TAX1基因中含有一個(gè)114bp大小的內(nèi)含子。
　　3.對(duì)黃綠木霉木聚糖酶蛋白進(jìn)行了氨基酸序列的分析，以及蛋白理化性質(zhì)和信號(hào)肽及保守區(qū)域的預(yù)測(cè)，該蛋白編號(hào)為:AIG72020.1，推測(cè)該蛋白的分子量為24.2044KD，理論等電點(diǎn)為6.82，分子式為C1086H1602N292O339S1，不穩(wěn)定系數(shù)為17.81，是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。并對(duì)其進(jìn)行了SDS-PAGE分析及活性電泳分析，得到了約24KD大小的

4、蛋白特異條帶，確定其最高酶活時(shí)間是在第五天。
　　4.構(gòu)建了TAX1基因在畢赤酵母中的表達(dá)載體TAX1-pPIC9K載體，并將重組載體轉(zhuǎn)化到了畢赤酵母GS115菌株中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)利用了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了相對(duì)定量分析，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基誘導(dǎo)4d時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高。
　　5.對(duì)重組木聚糖酶進(jìn)行了酶學(xué)特性分析，得到該木聚糖的最適反應(yīng)溫度為50℃，其在40℃到60℃溫度范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。最適pH為6.

5、0，該木聚糖酶在pH4.0-6.0之間具有較好的穩(wěn)定性，證明該木聚糖酶是一種酸性蛋白。最適底物為木聚糖，同時(shí)對(duì)秸稈也同樣具有較好的分解能力。以木聚糖作為底物時(shí)，該木聚糖酶的Vmax=44.25mg/ml·min,Km=0.36mg/ml, Kcat=Vmax/E=0.204S-1, Kcat/Km=0.57ml/S·mg。
　　6.對(duì)重組畢赤酵母木聚糖酶酶活性進(jìn)行測(cè)定，確定其最適產(chǎn)酶時(shí)間為5d，最適pH為6.0。此時(shí)，酶活力達(dá)到2