精子畸形試驗(yàn)

1、SRY基因的檢測(cè),目的要求掌握PCR反應(yīng)的基本原理掌握性別決定的分子機(jī)制掌握用PCR擴(kuò)增檢測(cè)性別的方法掌握用PCR擴(kuò)增檢測(cè)性別方法的應(yīng)用,原理,1聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的基本原理是，通過(guò)熱變性使目的DNA（模板DNA）雙鏈解開(kāi)；通過(guò)退火將引物復(fù)性結(jié)合到它們的互補(bǔ)位置；通過(guò)DNA聚合酶延長(zhǎng)引物，反復(fù)循環(huán)體外擴(kuò)增出大量一對(duì)引物之間的DNA片段。,聚 合 酶 鏈 反 應(yīng)Polym

2、erase Chain Reaction（PCR）,一種可以將目的微量的DNA片斷擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上的技術(shù),PCR 可以把 指定的基因片段 數(shù)量放大百萬(wàn)倍,,,,染色體,Mullis (1993),,,PCR基本工作原理,以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板3’和5’端相互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制延模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。重復(fù)這一過(guò)程，可使目的DNA片段得以擴(kuò)增。,PCR體

3、系基本組成成分,,含Mg2+的緩沖液,dNTPs,耐熱DNA聚合酶Tag DNA聚合酶,特異性引物一對(duì)分別與待擴(kuò)增DNA序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸片段。,模板DNA,PCR基本反應(yīng)步驟,變性95?C,延伸72?C,退火Tm-5?C,,,,循環(huán)25-30次,使模板DNA完全變性成單鏈。同時(shí)引物自身和引物之間存在的局部雙鏈得以消除,使引物和模板DNA退火結(jié)合,此溫度下DNA聚合酶以dNTP 為底物催化DNA鏈的延長(zhǎng),三個(gè)步驟為一個(gè)

4、循環(huán)，每次循環(huán)產(chǎn)物作為下一輪模板進(jìn)入下一輪循環(huán),第一輪循環(huán),引物A,引物B,,,,變性（95℃）,退火（60℃）,延伸（72℃）,DNA-Pol,DNA-Pol,溫度,第二輪循環(huán),引物A,引物B,,,,℃,變性（95℃）,退火（60℃）,延伸（72℃）,溫度,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,第三次循環(huán),,,,,,,,,,,變性（95℃）,退火（60℃）,延伸（72℃）,,,,,,,,,,溫度,DNA-P

5、ol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,第一次循環(huán),第二次循環(huán),第三次循環(huán),第四次循環(huán),,,,,,,,,,,PCR的主要用途,PCR的用途,基因突變分析,基因的體外突變,目的基因的克隆,DNA序列測(cè)定,DNA和RNA的微量分析,1、與反轉(zhuǎn)錄結(jié)合，直接從組織細(xì)胞中的mRNA 獲得目的基因；2、利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得目的基因

6、片段；3、利用簡(jiǎn)并引物從cDNA 文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得具有一定序列相似性的基因片段；4、利用隨機(jī)引物從cDNA文庫(kù)中克隆基因。,利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的DNA的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。,PCR技術(shù)高度敏感，對(duì)DNA的含量要求很低。理論上只要存在一分子的模板就可以獲得目的片段。RNA需要反轉(zhuǎn)錄。,利用PCR結(jié)合其它技術(shù)，可以提高基因突變檢測(cè)的敏感性。,原理,2 人類(lèi)個(gè)體的表型性別是由Y染色體決定的,

7、具體地說(shuō)是由Y染色體上編碼睪丸發(fā)育的睪丸決定因子(testis determining factor,TDF)基因所決定，TDF基因的存在決定著睪丸的發(fā)育，即決定個(gè)體發(fā)育為男性。研究表明TDF基因位于Y染色體短臂與擬常染色體相接的35kb區(qū)域，該區(qū)域又稱(chēng)為Y染色體性別決定區(qū)（sex determining region of the Y，SRY）。 。,3 在SRY基因區(qū)域設(shè)計(jì)特異的引物，如果能夠利用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增出SRY基因片段，

8、即可判斷為男性，否則為女性。本實(shí)驗(yàn)在SRY基因區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，利用引物Y1.5/ Y1.6擴(kuò)增出一239bp的片段。4 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增SRY基因片段檢測(cè)性別具有廣泛的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，如結(jié)合細(xì)胞遺傳學(xué)的核型分析，通過(guò)確認(rèn)SRY所在區(qū)域的缺失或易位，診斷46，XY女性或46，XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征的患者；通過(guò)檢測(cè)胎兒的性別，預(yù)防甲型血友病、G6PD缺乏癥等X連鎖隱性遺傳病患兒的出生；,5 通過(guò)骨髓移植后Y染色體特異的SRY基因片段的

9、DNA分析是由陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性或相反，來(lái)判斷異性別的骨髓移植程度；多年尸塊的DNA常有降解，而PCR只分析DNA的一小部分，不受降解的影響，因此本實(shí)驗(yàn)技術(shù)常應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)上尸塊或血斑的性別確定；此外，本實(shí)驗(yàn)還可用于需要快速、準(zhǔn)確、同時(shí)需檢查大量標(biāo)本的運(yùn)動(dòng)員體檢。,一、 由微量外周血標(biāo)本制備模板DNA 試劑與材料： 1、 細(xì)胞裂解緩沖液 （SDS ；蛋白酶K ）　　2、酚：氯仿：異戊醇（25：24：1體積比）

10、 　 3、3mol醋酸鈉（PH5.2）　 4、無(wú)水乙醇，-20℃保存　 5、70%乙醇，-20℃保存 6、TE緩沖液,,,,,,,,,,,,,步驟,1、1.5ml Eppendorf離心管中加入細(xì)胞裂解液100μl。2、取末梢血一滴（約5-10μl）立即懸浮細(xì)胞裂解液中，37℃保溫2小時(shí)。3、加入100μl酚：氯仿：異戊醇（25：24：1體積比）混合液，蓋緊

11、。輕輕搖混，充分混合；室溫15000rpm離心5分鐘。4、用開(kāi)口粗的吸管轉(zhuǎn)移上層水相于新的Eppendorf離心管，按步驟5重復(fù)抽提1次。如果水相還混濁，增加一次酚抽提。,步驟,5、轉(zhuǎn)移上層水相，加入10μl 3mol醋酸鈉（PH5.2）輕搖混勻，再加入250μl冷無(wú)水乙醇沉淀DNA。室溫放置10分鐘。6、4℃15000rpm離心15分鐘，使DNA沉淀（顆?；?、棄上清，加70%冷乙醇500μl輕振混勻，4℃15000rpm離

12、心5分鐘。8、棄上清，將Ep管倒置在紙巾上，完全除去水分。將DNA自然干燥。9、加10μl TE溶解，制成DNA樣品。（進(jìn)行PCR時(shí)，取1μl即可）。,二、PCR檢測(cè)性別 試劑與材料：1、   上、下游引物 （各5 μmol/L）2、   模板DNA溶液3、   10×PCR緩沖液：（高壓滅菌）4、   dNTPs溶液（2.

13、5mmol/L原液）5、   Taq DNA聚合酶（5U/μl）6、   液體石蠟（高壓滅菌）,瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段 7、電泳級(jí)瓊脂糖8、電泳緩沖液：5×TBE貯存液 9、5mg/ml的溴化乙錠溶液，4℃暗存。10、上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，30%甘油于水中。4℃貯存。11、微波爐、電泳儀、水平電泳槽、制膠模和加樣孔梳齒。12、透射紫外燈、

14、照相機(jī)和膠帶紙。,,實(shí)驗(yàn)步驟： （一）、SRY基因引物設(shè)計(jì) Y1.5 5ˊ-CTA GAC CGC AGA GGC GCC AT- 3ˊ Y1.6 5ˊ-TAG TAC CCA CGC CTG CTC CGG- 3ˊ 擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度239bp,（二）、PCR反應(yīng) 1、   在0.5ml Eppendorf

15、管中依次加入H2O 60.5μl10×PCR緩沖液 10μldNTPs溶液（2.5mmol/L原液） 8μl（0.2mmol/L）上游引物 （5 μmol/L） 10μl （0.5μmol/L）下游引物 （5 μmol/L

16、） 10μl（0.5μmol/L）模板DNA溶液（基因組DNA溶液） 1μl Taq DNA聚合酶（5U/μl） 0.5μl（2.5U/100μl） 總量 100μl,,2、   混勻，短暫離心。3、   PCR條件Y1.5/ Y1.6P

17、CR擴(kuò)增條件：變性 95℃5分鐘 變性 94℃75秒 復(fù)性 55℃90秒 延伸 72℃150秒循環(huán)30次。擴(kuò)增產(chǎn)物冷卻至室溫可于4℃保存。,,,,（三）、擴(kuò)增產(chǎn)物分析（方法參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)四、瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段） 1、組裝制膠模。2、參照瓊脂糖凝膠的分離能力表選擇