實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)-課程中心-浙江大學(xué)

1、實(shí)驗(yàn)室規(guī)則,接觸到病原菌，一定要堅(jiān)持無菌操作進(jìn)實(shí)驗(yàn)室穿上白大衣，離開時(shí)反折嚴(yán)禁飲食，也不要以手撫摸頭、面等部位若發(fā)生吸入菌液，割破手指等事故，必須報(bào)告老師接觸過菌液的吸管、玻片等器材，投入含有2~3%來蘇兒的容器內(nèi)實(shí)驗(yàn)完畢，整理桌面,微生物實(shí)驗(yàn)要求,做實(shí)驗(yàn)后要認(rèn)真完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，所得結(jié)果必須真實(shí)記錄,浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告,課程名稱： 實(shí)驗(yàn)類型：

2、 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目名稱： 學(xué)生姓名： 專業(yè)： 學(xué)號(hào)： 　　　　 同組學(xué)生姓名： 指導(dǎo)老師： 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)： 實(shí)驗(yàn)

3、日期： 年 月 日實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅ū靥睿?shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）主要儀器設(shè)備操作方法與實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（必填）討論、心得,實(shí)驗(yàn)一革蘭氏染色、細(xì)菌接種,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,一，革蘭氏染色（操作）二，細(xì)菌接種平板劃線法（操作）斜面培養(yǎng)基接種法（操作）半固體培養(yǎng)基接種法/穿刺接種法（操作）液體培養(yǎng)基接種法（操作）細(xì)菌在液體、固體、半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象（示教）,顯微鏡的使用和保護(hù) -

4、-- 原理,油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間不是隔一層空氣，而是隔一層油質(zhì)稱為油浸系。這種油常選用香柏油如果玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，稱為干燥系，當(dāng)光線通過載玻片后，受折射發(fā)生散射現(xiàn)象，進(jìn)入物鏡的光線顯然減少，這就降低了視野的照明度香柏油的折射率n＝1.515，與玻璃n＝1.52相近。當(dāng)光線通過載玻片后，可直接通過香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射,油浸沒物鏡 介質(zhì)：空氣；香柏油,油鏡的識(shí)別,油鏡的鏡筒最長，透鏡直徑最小，上面刻有9

5、0倍或100倍或Oil等,油鏡的使用,先按低倍鏡到高倍鏡的操作步驟找到物像，并將觀察部分移至視野的中央。 轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)盤，使高倍鏡移向一側(cè)，在蓋玻片上滴一滴香柏油，然后將油鏡對(duì)準(zhǔn)通光孔，使油鏡下端與香柏油接觸(注意操作動(dòng)作要慢，以免壓碎玻片或損壞鏡頭)。 從目鏡內(nèi)觀察，微微上下轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)器，至視野內(nèi)出現(xiàn)清晰的物像時(shí)為止。 油鏡使用完畢后，必須用拭鏡紙沾少許二甲苯將油鏡上的香柏油擦凈，并用干的拭鏡紙檫去二甲苯。顯微鏡用畢后，升高鏡簡，

6、取下玻片標(biāo)本，轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)盤，使每個(gè)物鏡都不對(duì)準(zhǔn)通光孔，再下降鏡筒，使物鏡接近載物臺(tái)，將聚光鏡降下，最后放回櫥內(nèi)。,革蘭染色法,由丹麥C.Gram于1884年創(chuàng)立，是細(xì)菌學(xué)中很重要的鑒別染色法，通過此法染色，可將細(xì)菌鑒別為革蘭陽性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-）兩大類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu),革蘭染色法－－原理,G＋菌胞壁結(jié)構(gòu)致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，乙醇不易透入。同時(shí)乙醇使細(xì)胞壁脫水形成一道屏障，阻止結(jié)晶紫—碘復(fù)合物從胞內(nèi)滲出，故細(xì)菌仍保留初

7、染時(shí)的紫色。G－菌胞壁結(jié)構(gòu)較為疏松，肽聚糖層很薄，外膜含大量脂質(zhì)，易被乙醇溶解，致使細(xì)胞壁通透性變大，使結(jié)晶紫--碘復(fù)合物被乙醇溶解析出而脫色，故細(xì)菌呈復(fù)染時(shí)的紅色,革蘭染色方法,初染：滴加結(jié)晶紫染液,染1分鐘,水洗. 媒染：滴加盧戈氏碘液,作用1分鐘后,水洗. 脫色：加95%酒精2~3滴于涂片上,頻頻搖晃3~5秒鐘后,斜持玻片,使酒精流去;再滴加酒精,如此反復(fù)2~3次,直至流下的酒精無色或稍呈淡紫色時(shí)為止,約半分鐘。水洗復(fù)染：

8、滴加稀釋石炭酸復(fù)紅染1/2~1分鐘,水洗,待干,油鏡檢查. （紫碘酒紅、分分半半）,革蘭染色結(jié)果 -- 陽紫陰紅,凡能固定結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物,而不易被酒精脫色,仍保留紫色,稱為革蘭陽性菌. 凡易能被酒精脫色,再經(jīng)復(fù)染成紅色的細(xì)菌,稱為革蘭陰性菌,仔細(xì)觀察（染色性，形態(tài)，排列），繪圖,革蘭染色的意義,鑒別細(xì)菌：鑒別G+, G-,初篩標(biāo)本選擇用藥致病物質(zhì)大多  G+　外毒素，G- 內(nèi)毒素,細(xì)菌材料玻片標(biāo)本制備,涂片-

9、-----干燥------固定涂片：先取一接種環(huán)生理鹽水放于載玻片的一端，左手持菌液試管，右手持接種環(huán)，用接種環(huán)從試管培養(yǎng)液中挑取少許大腸桿菌或葡萄球菌培養(yǎng)物與鹽水混勻，涂成直徑約1厘米的涂片，涂片應(yīng)薄而均勻。干燥：涂片最好放置室溫中，待其自然干燥。固定：手執(zhí)玻片的一端標(biāo)本面向上，在火焰外層較快地來回通過三次，約2~3秒，以玻片反面觸及皮膚，以不覺過分地燙為度。待放置冷卻后，進(jìn)行染色。掌握無菌操作拔或塞試管帽時(shí)，應(yīng)將試管口通過

10、火焰略加燒灼；接種環(huán)使用前后應(yīng)在火焰上燒灼滅菌,固定的目的,① 殺死微生物，固定其細(xì)胞結(jié)構(gòu)② 保證菌體能牢固地粘附在載玻片上，以免水洗時(shí)被水沖掉③ 改變菌體對(duì)染料的通透性，一般死細(xì)胞原生質(zhì)容易著色。,細(xì)菌生長繁殖的條件,充足的營養(yǎng)物質(zhì)水，碳源，氮源，無機(jī)鹽，生長因子 合適的外界環(huán)境溫度酸堿度氣體滲透壓,培養(yǎng)基的類型,1.按照培養(yǎng)基的成分來分　　(1)合成培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基的各種成分完

11、全是已知的各種化學(xué)物質(zhì)。這種培養(yǎng)基的化學(xué)成分清楚，組成成分精確，重復(fù)性強(qiáng)，但價(jià)格較貴，而且微生物在這類培養(yǎng)基中生長較慢。如高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基、察氏（Czapek）培養(yǎng)基等?！　?2)天然培養(yǎng)基。由天然物質(zhì)制成，如蒸熟的馬鈴薯和普通牛肉湯，前者用于培養(yǎng)霉菌，后者用于培養(yǎng)細(xì)菌。這類培養(yǎng)基的化學(xué)成分很不恒定，也難以確定，但配制方便，營養(yǎng)豐富，所以常被采用?！?(3)半合成培養(yǎng)基。在天然有機(jī)物的基礎(chǔ)上適當(dāng)加入已知成分的無機(jī)鹽類，或在合成

12、培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加某些天然成分，如培養(yǎng)霉菌用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。這類培養(yǎng)基能更有效地滿足微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的需要。,2.按照培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分　(1)固體培養(yǎng)基。是在培養(yǎng)基中加入凝固劑，有瓊脂、明膠、硅膠等。固體培養(yǎng)基常用于微生物分離、鑒定、計(jì)數(shù)和菌種保存等方面?！?2)液體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基中不加任何凝固劑。這種培養(yǎng)基的成分均勻，微生物能充分接觸和利用培養(yǎng)基中的養(yǎng)料，適于作生理等研究，由于發(fā)酵率高，操作方便，也常用于發(fā)酵工業(yè)。

13、 (3)半固體培養(yǎng)基。是在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑而呈半固體狀態(tài)?？捎糜谟^察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)、鑒定菌種和測定噬菌體的效價(jià)等方面。,3.按照培養(yǎng)基用途分：　(1)加富培養(yǎng)基。是在培養(yǎng)基中加入血、血清、動(dòng)植物組織提取液，用以培養(yǎng)要求比較苛刻的某些微生物?！?2)選擇性培養(yǎng)基。是根據(jù)某一種或某一類微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)σ恍┪锢?、化學(xué)抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基可以將所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來?！?3)鑒別培養(yǎng)基。是

14、在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使培養(yǎng)后會(huì)發(fā)生某種變化，從而區(qū)別不同類型的微生物。,一，平板劃線法（操作）,,平板分區(qū)劃線,平板分區(qū)劃線,平板劃線法,是一種分離培養(yǎng)法,接種,,培養(yǎng),長出單個(gè)菌落,實(shí)驗(yàn)步驟（平板劃線法）,不要說話，嚴(yán)格無菌操作灼燒接種環(huán)后要冷卻取一環(huán)葡萄球菌或大腸桿菌劃線時(shí)用腕力，不要使接種環(huán)嵌入瓊脂各個(gè)分區(qū)要分明在培養(yǎng)皿底部貼標(biāo)簽倒置培養(yǎng)以防止結(jié)晶水沖散細(xì)菌,二，斜面培養(yǎng)基接種法（操作）,,斜面接種時(shí)的無

15、菌操作(1)接種滅菌 (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞,實(shí)驗(yàn)步驟（斜面接種法）,用左手握住菌種管（葡萄球菌或大腸桿菌）和斜面培養(yǎng)基管，右手持接種環(huán)。用右手小指與手掌、小指與無名指分別拔出兩管的棉塞，將管口通過火焰滅菌。用接種環(huán)或接種針伸入菌種管內(nèi)，挑取用來接種的菌苔。伸入斜面培養(yǎng)管內(nèi)，先從斜面底部到頂端拖一條接種線，再自下而上蜿蜒劃線。接種完成之后，用火焰滅菌培養(yǎng)管口，并塞上棉塞，置于

16、37℃培養(yǎng)。,三，半固體培養(yǎng)基接種法/ 穿刺接種法（操作）,穿刺接種法,實(shí)驗(yàn)步驟（穿刺接種法）,用左手握住菌種管（大腸桿菌或痢疾桿菌）和半固體培養(yǎng)管，右手持接種針。用右手小指與手掌、小指與無名指分別拔出兩管的棉塞，將管口通過火焰滅菌幾次。用接種針伸入菌種管內(nèi)，挑取用來接種的菌苔。垂直刺入半固體中心，至近管底部，然后沿穿刺線退出。塞回棉塞，接種針重新滅菌。接種完畢，于37℃培養(yǎng)18—24h，觀察生長情況。,