雙向電泳的技術(shù)流程和樣品制備

1、文庫專用,1,雙向電泳的技術(shù)流程和樣品制備,史須北京大學(xué)人類疾病基因研究中心,文庫專用,2,基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué),基因組學(xué)：蛋白質(zhì)組學(xué)：可視為分子生物學(xué)的大規(guī)模篩選技術(shù)，目的在于歸類細胞中的蛋白質(zhì)的整體分布，鑒定并分析感興趣的個別蛋白，最終闡明它們的關(guān)系與功能。上述兩種學(xué)科的研究內(nèi)容在互補的水平上研究了細胞的分子架構(gòu)，又都在各自的水平上提供了增強對方效應(yīng)的信息，因此二者存在有很強的且?guī)в邢到y(tǒng)性相互關(guān)系。,文庫專用,3,Appl

2、ications of proteomics,? Protein identification/characterization ? Protein-protein interaction ? Post-translational modifications ? Subcellular location ? Elucidation of pathway ? Target validation and toxicology ?

3、 Drug discovery,文庫專用,4,蛋白質(zhì)組分析的首要要求,將來自于全細胞、組織或生物體中所包含的多達幾千種混合蛋白質(zhì)進行分離、檢測和分析 。2-DE技術(shù)依然是大多數(shù)蛋白質(zhì)組研究中分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的首選技術(shù) 。,5,生物學(xué)問題的提出,實驗?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計,實驗組和對照組樣品的制備,蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離,圖像掃描和初步分析,感興趣蛋白點的切取,胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化,質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析,質(zhì)譜結(jié)果的生物信

4、息學(xué)分析和比對,新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn),其它實驗的進一步驗證,,,,,,,,,,,蛋白信息的初步獲得,,,,文庫專用,6,蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線,蛋白質(zhì)樣品的制備,,雙向電泳,圖像分析,,,轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白,凝膠中的蛋白,溶液中的蛋白,,,混合肽,,,蛋白質(zhì)質(zhì)量,N端測序,,,,肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù),肽指紋圖,,,,,,,數(shù)據(jù)搜索,新的或已知蛋白,蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定,,,,,,,,,文庫專用,7,雙向電泳分析中的樣品制備,制備原則：應(yīng)使所有待

5、分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。,文庫專用,8,可溶性樣品,固體組織樣品,細胞,不同樣品的基本處理方法,樣品的分級處理通過采用亞細胞分級、液相電泳和選擇性沉淀等方法對蛋白

6、質(zhì)樣品進行分級處理，可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當前最簡單有效的處理是采用分級抽提，按樣品溶解度不同進行分離。,文庫專用,9,樣品的溶解,是2-DE成功分離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一。溶解的目標：1、樣品中非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個多肽的溶解液（否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點，相應(yīng)的表示單個多肽的點的強度會下降）；2、溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和

7、核酸等物質(zhì)的去除；3、溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)。,文庫專用,10,增加樣品溶解性的手段,變性劑：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性劑：經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團。常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑Triton X-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS、OBG

8、等。其中CHAPS和SB3-10最好。還原劑：在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或?-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（TBP）進行還原。,文庫專用,11,起載體作用的兩性電解質(zhì)：即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于PI點時會發(fā)生沉淀。Carrier ampholytes的作用在于捕

9、獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2％（w/v)。濃度過高會使IEF的速度降低。另外，為了保證實驗的精確性，在選擇不同pH范圍的IPG膠條時，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的pH值與之相符合。,文庫專用,12,樣品液的準備,標準液：,文庫專用,13,Suggested Bio-lyte ampholyte composition for IPG use,文庫專用,14,Multiple chaotropic

10、 agent solution preparation,文庫專用,15,Multiple surfactant solution preparation,文庫專用,16,樣品中核酸的去除,對電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后會出現(xiàn)假象遷移和條紋。解決方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內(nèi)切酶進行降解，或是利用合成載體兩性電解質(zhì)（SCA）同核酸結(jié)合形成復(fù)合物的能力，再通過超速離心來去除復(fù)合物。,文庫專用,17,亞蛋白質(zhì)組樣品的制

11、備,用超離心技術(shù)分離出細胞器、質(zhì)膜和細胞核等成分，再用適當?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進行溶解。其優(yōu)點是不僅大大減少樣品的復(fù)雜性，而且可對分離的蛋白質(zhì)進行亞細胞定位。但該法需要專業(yè)儀器，有時會出現(xiàn)假陽性。順序抽提法：根據(jù)細胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進行抽提的方法。第一步：用Tris堿溶液裂解細胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用標準IEF樣品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液

12、，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個樣品的11%（W/W）。,文庫專用,18,特殊樣品的制備,低豐度蛋白的分離：盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時的低豐度蛋白的量，但同時增加了高豐度蛋白的負荷，且造成蛋白的疊加效應(yīng)而影響分離?，F(xiàn)常用預(yù)分級＋窄pH膠的微制備技術(shù)進行分離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群，再用pH梯度小于2個pH單位的IPG膠進行窄pH范圍的分離。,文庫專用,19,強堿性蛋白質(zhì)（如核糖體 ）的處理：先將蛋

13、白預(yù)處理以富集，再用特殊pH梯度的IPG膠條（如pH3－12、4-12或10-12）進行等電聚焦。其中窄范圍堿性IPG膠（如pH10-12）的挑戰(zhàn)是克服反向、陰極向陽極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性IPG膠（如pH3-12、4-12）等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液。極端分子量的蛋白質(zhì)：小于8kD和大于200kD的蛋白在常規(guī)IPG-2D上不易看到，這可能是在Tris/glycine緩沖液中，樣品和游離的dodelcyl su

14、lfate ions持續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生對流混合，產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽，或者可能是大分子。,文庫專用,20,一維固相pH梯度等電聚焦（IEF with IPG）：,IPG膠的材料是Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結(jié)構(gòu)的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基

15、或叔氨基團，它們構(gòu)成了分布在pH3~10不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計算后，將適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團通過乙烯鍵共價聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通過這種方式生成的IPG不會發(fā)生電滲透作用，因而可以進行特別穩(wěn)定的IEF分離達到真正的平衡狀態(tài)。,文庫專用,21,IPG膠條的重泡脹,泡脹的實質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進入IPG內(nèi)，從而能進行接下來的IEF。 不同的加樣方法和加樣量會導(dǎo)致

16、最終結(jié)果的差異：Protean IEF cell、IPGphor等集成設(shè)備的使用： 20mmol/L DTT 墊片的使用：溫度的選擇：,文庫專用,22,蛋白載樣量,影響IPG膠條對蛋白載樣量的因素包括：待分析的蛋白點的量應(yīng)滿足隨后的質(zhì)譜分析。電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無需考慮太多其它因素。待研究蛋白的豐度：樣品的復(fù)雜度：復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復(fù)實驗才能完成。如果將待檢樣品被

17、富集以后則更易分析。IPG膠條的pH范圍：,文庫專用,23,IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量,文庫專用,24,IPG IEF 中pH梯度的選擇,常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預(yù)試驗確定。,文庫專用,25,預(yù)分步收集,細胞漿,細胞核,細胞膜,核糖體及其他特定細胞成份,細胞分泌成份,,,,,,,,,,,pH4-12,pH3-10,,,,,pH4-7,pH5-8,pH7-10,pH6-11,pH3-6,,,pH3-4,pH4-5

18、,pH5-6,pH6-7,pH7-8,pH8-9,pH9-10,pH10-11,pH11-12,第一步,第二步,第三步,,,用窄pH范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋白,陣列那些亞細胞定位位置的功能蛋白質(zhì),,,,,,亞蛋白質(zhì)組陣列策略的框架圖,3倍,3倍,文庫專用,26,聚焦時間的優(yōu)化,理論上講，要獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需最佳時間是IEF分離達到穩(wěn)定態(tài)所需的時間。聚焦時間太短，會導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。過度聚焦雖然不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)

19、向陰極漂移，但會因為活性水轉(zhuǎn)運而導(dǎo)致過多水在IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。最佳時間的確定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長度通過經(jīng)驗來確定。,文庫專用,27,IEF的基本條件,,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,total,voltage,Time,Volt-Hours,Ramp,250,20min,－－－,Linear,4000,4000,2hr,－－－,

20、－－－,10,000V-hr,Linear,Rapid,5 hr,14,000V-hr,,7 cm,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,total,total,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,,,11 cm,17 cm,250,250,8000,10000,10000,8000,20min,20min,2.5hr,2.5hr,－－－,－－－,－－－,－－－,－－－,－－－,20,000V-hr,40,000V

21、-hr,～30,000V-hr,～50,000V-hr,5.3 hr,7 hr,Linear,Linear,Linear,Linear,Rapid,Rapid,文庫專用,28,兩維間的平衡,一維結(jié)束后可馬上進行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于－80°保存數(shù)月。但在二維電泳前一定要進行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合，從而在SDS-PAGE是電泳能順利進行。建議方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v

22、)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mM Tris（pH8.8）緩沖液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述緩沖液平衡15min。如果用TBP代替DTT則只需一步平衡。,文庫專用,29,二維SDS-PAGE,同普通SDS-PAGE類似。但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，因為在IPG膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認為非限制性IEF膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當了濃縮膠。,文庫專用,30,聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上

23、的蛋白質(zhì)的檢測,理想顯色劑的7S安全（safety）：靈敏（sensitivity）：簡單（simplicity）：特異性（specificity）：快速（speed）：穩(wěn)定（stability）：兼容性（synergy）：,文庫專用,31,有機染料和銀染,考染靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍；銀染的線性范圍是40倍，靈敏度是考染的100倍。膠體考馬斯亮藍染色技術(shù)可實現(xiàn)PAGE的無背景染色，其極限靈敏度為8~1

24、0ng，但這種染液會對蛋白質(zhì)進行修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果。胺基黑常用于轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色。銀染的缺點是：對某些種類的蛋白質(zhì)染色效果差，對其后的蛋白質(zhì)測序和質(zhì)譜分析造成影響。這兩種染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。,文庫專用,32,負 染,能專門提高PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率，但不能用于膜上染色。結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點透明。速度快（5~15min），蛋白質(zhì)的生物活性能保持

25、：一旦用絡(luò)合劑如EDTA或Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來絡(luò)合金屬離子就可進行提取來轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。它主要適用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)的膠上被動提取以及質(zhì)譜分析。該技術(shù)主要包括金屬鹽染料、鋅－咪唑染料等的使用。,文庫專用,33,膠體擴散染料,主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和PVDF膜上的蛋白質(zhì)，不用于膠內(nèi)染色。最好的膠體金染色的靈敏度與PAGE膠內(nèi)的銀染類似。這種技術(shù)主要包括印度墨水染料、膠體金屬染料等。,文庫專用,34,有機熒

26、光團染料,包括共價結(jié)合和非共價結(jié)合的熒光團染料兩類。后者最為常用，其典型代表是已經(jīng)商品化的SYPRO Red、 Orange、 Ruby等熒光染料。這三種染料可對SDS-PAGE膠內(nèi)蛋白質(zhì)進行一步染色，約30~60min完成，靈敏度為2~10ng。染色后的凝膠用標準的實驗室300nm紫外透射儀進行照像保存，其線性范圍為3個數(shù)量級。這三種染料的電泳染色結(jié)果與在酵母中通過SAGE所獲得的基因表達水平的動態(tài)范圍相匹配。在Tris/甘氨酸

27、轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后，蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進行免疫染色或Edman測序來鑒定蛋白質(zhì)。,文庫專用,35,金屬螯合染料,這是一類與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容的、相對較新的蛋白質(zhì)顯色試劑，其設(shè)計專門與常用微量化學(xué)表征過程兼容。它們不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白質(zhì)組學(xué)平臺（包括自動化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機器人剪切儀器、蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀等）相結(jié)合。其中SYPRO Ruby也是一種基于釕的金屬發(fā)光染料。,

28、文庫專用,36,凝膠的圖像處理分析和,典型流程凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點檢測和定量：凝膠配比：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)呈遞和解釋：2-DE數(shù)據(jù)庫的建立：,文庫專用,37,蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶切,包括感興趣蛋白點的挖取、含蛋白質(zhì)凝膠的脫色、膠內(nèi)蛋白質(zhì)的酶切等過程,文庫專用,38,質(zhì)譜技術(shù)進行蛋白質(zhì)鑒定的基本流程,樣品制備,與IPG膠條水化,IPG電泳,與上樣緩沖液浸潤,SDS-PAGE,轉(zhuǎn)PVDF膜,膠內(nèi)直接染色,染色,取出蛋白點,胰

29、酶等消化,濃縮于多孔吸附柱上,MALDI-MS肽指紋圖,數(shù)據(jù)庫查詢,蛋白質(zhì)鑒定,已知,反向HPLC分離,MALDI-MS，PSD片段分析,示知,ESI-MS-MS、微測序,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,文庫專用,39,實驗方法完整蛋白質(zhì)（如凝膠分離或色譜純化蛋白質(zhì)）,肽混合物,質(zhì)譜測定肽質(zhì)量（MALDI-MS,ESI-MS),選擇肽段裂解PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS),計算方法蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（

30、＋核酸序列翻譯數(shù)據(jù)庫）,肽質(zhì)量檢索：片1.ppt,未解析碎片離子檢索：片2.ppt,,,酶切,,,,,質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的策略,文庫專用,40,體外 pmol,[32P]蛋白質(zhì)標記,蛋白質(zhì)分離,蛋白酶切,2D磷酸化做圖,?LC-ESI-MS或MALDI-MS,?LC-ESI-MS,?HPLC,IMAC,磷酸化氨基酸分析,體內(nèi),[32P]細胞標記,蛋白酶切,2D磷酸化做圖,,,,,,,,,,,,,相關(guān)分析,磷酸化位點分析策略,,,,文庫專用,

31、41,非變性2D-PAGE：兩向均在非變性條件下進行，這樣分離的蛋白質(zhì)點的等電點和表觀分子量同生理條件下獲得的這些蛋白的值是一樣的；非變性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非變性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的條件下進行。適于分析非共價鍵連接的蛋白－蛋白間的相互作用。非變性/還原/SDS-2D-PAGE：非變性條件下IEF聚焦，之后用8M尿素＋5%β-ME＋2%SDS進行平衡，再進行第二向SDS-PAG電

32、泳。此時分離的蛋白質(zhì)點可進行點的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鑒定，提供關(guān)于斷裂二硫鍵連接的多肽的信息。變性2D-PAGE：樣品先用2%SDS＋5%β-ME＋95℃變性5min，IEF在8M尿素＋1%NP-40條件下進行，之后膠條用2%SDS＋5%β-ME平衡，然后進行SDS-PAGE。該技術(shù)適于DNA序列和多肽結(jié)構(gòu)的分析，或分析被碳氫鍵連接和其它翻譯后修飾所引起的多肽結(jié)構(gòu)微異質(zhì)性，但此方式顯示的大于100Kd的蛋白質(zhì)