水牛精液雙向電泳技術(shù)的初步研究.pdf

1、精子發(fā)育的各個階段均有大量的蛋白質(zhì)參與，分離和鑒定精子相關(guān)蛋白質(zhì)，可為在蛋白質(zhì)水平上闡明精子發(fā)生機(jī)制，揭示雄性不育機(jī)理提供重要信息。本試驗(yàn)以水牛精子和精漿為研究對象，建立了雙向凝膠電泳技術(shù)-質(zhì)譜技術(shù)（2DE-MS）分離、分析精子/精漿蛋白質(zhì)組的技術(shù)平臺，為實(shí)驗(yàn)室今后深入開展水牛精子蛋白組學(xué)研究提供可行的技術(shù)理論體系。
　　 通過對不同蛋白質(zhì)提取方法、IPG膠條和不同上樣量等相關(guān)參數(shù)的比較和優(yōu)化，結(jié)果顯示，選用裂解液B，24cm

2、pH3～10的IPG膠條，200ug上樣量的方法，得到清晰的水牛精子蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，運(yùn)用ImageMaster2D platinum分析軟件檢測出約500個蛋白質(zhì)點(diǎn)，蛋白質(zhì)大部分分布在等電點(diǎn)4～7之間，蛋白質(zhì)分子量范圍約40-90kDa。水牛精漿中選用13cm pH3-10的IPG膠條，100ug上樣量的方法，檢測出約200個蛋白質(zhì)點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子量范圍26-66kDa，主要分布在pH4-7之間，并且在14kDa附近有高豐度蛋白。

3、r>　　 選取約250個豐度較高的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，用于初步構(gòu)建精子蛋白質(zhì)組表達(dá)譜。膠內(nèi)酶解后使用AB4800 MALDI-TOF-TOF飛行時(shí)間質(zhì)譜儀肽段質(zhì)量指紋圖譜，通過數(shù)據(jù)庫搜索后，成功鑒定出151個蛋白質(zhì)信息。對鑒定出的蛋白質(zhì)使用GeneOntology（GO）工具，分別從細(xì)胞結(jié)構(gòu)、分子功能和生物學(xué)過程方面分析蛋白質(zhì)在精子發(fā)育過程中可能的功能。
　　 綜上所述，本研究建立了適合分離水牛精子蛋白質(zhì)的雙向電泳體系，結(jié)合